第七章 酶非水相催化

第七章酶非水相催化观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueousenzymology)。对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，并成功地在有机介质中利用酶的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。——非水酶学第一节酶非水相催化的主要内容受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同酶的非水相催化类型主要包括:一、有机介质的酶催化；二、气相介质的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；四、离子液介质中的酶催化go有机介质中的酶催化指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应;适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性物质的酶催化作用;原因:酶在有机相中能保持结构的完整;特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。气相介质中的酶催化指酶在气相介质中进行催化反应；适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水相中明显不同；超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；超临界流体指温度和压力超过临界点的流体；supercritical状态，简称SC状态；由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的物理化学性质。要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。优点：1)与水相比较，脂溶性反应物和产物可溶于超临界CO２中，而酶作为蛋白质不溶解，有利于三者的分离；2)产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，可解决环境污染问题；3)与有机溶剂体系相比，CO２无毒，不燃烧、廉价、无有机溶剂残留之虞；4)CO２超临界体系具有气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力使底物向酶的传质速度加快从而使反应速度提高，且在临界点附近，溶解能力和介电常数对温度和压力敏感，故反应速度提高。亦可以控制反应速率和反应平衡；5)可简化产物的分离，有可能将反应和分离过程耦合。已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。反应条件温和，反应温度低于50℃Back离子液介质中的酶催化指酶在离子液中进行催化作用；离子液Ionicliquids(ILs)是有机阳离子与有机（无机）阴离子在室温下呈液态低熔点盐类，挥发性低，稳定性好；特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响go1、微水介质体系；2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系；3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；4、（正）胶束体系；5、反胶束体系。一、有机介质反应体系1、微水介质体系是有机溶剂和微量水组成的反应体系;微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要;另一部分水分配在有机溶剂中;酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中;是常见的有机反应体系.2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系由水与极性较大的有机溶剂互混组成；水与有机剂含量均较大；适用的酶较少；辣根过氧化酶（HRP）应用：催化酚类或芳香胺类聚合成聚酚或聚胺类物，在环保黏合剂、导电聚物、发光聚合物材料中有重要作用。3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机相；固定化酶在界面；催化反应在两相界面进行；适于底物或产物属于疏水化合物的反应。4、（正）胶束体系大量水溶液中含少量与水不溶的有机溶剂，加入表面活性剂形成水包油微小液滴；表面活性剂极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂包在液滴内部;酶在水溶液中,疏水底物或产物在胶束内,反应在胶束界面进行.水相有机相酶5、反相胶束体系反相胶束:在与水不互溶的在量有机溶剂中,加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴；1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；酶分子处在反胶束内，稳定性好；反胶束与生物膜有相似之处，适于研究生物膜表面酶的结构、催化特性、动力学特性。水相有机相酶二、水对有机介质中酶催化的影响水在酶催化反应中发挥着双重作用:一方面,水分子直接或间接地通过氢键疏水键及范德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象,与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活性是至关重要的,称之为必需水,不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不同的;水的影响另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活:(1)形成不规则结构;(2)二硫键受到破坏;(3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸;(4)天冬氨酸肽键发生水解.因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.1、水对酶分子空间构象的影响无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层;必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量;不同的酶所需求的必需水的量差别较大;每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需3.5×102个水分子原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。2.水对酶催化反应速度的影响典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。有机介质中含两类水：结合水、游离水；在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大；然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响；为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用水活度（aw）描述有机介质中酶催化活力与水的关系：水活度：体系中水的逸度与纯水逸度之比；用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示；Aw=P/PoP：一定条件下体系中水的蒸汽压Po:相同条件下纯水的蒸汽压水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用水活度作参数更确切；3.水活度（activityofwater)有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行;三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用三有机溶剂对有机介质中酶催化的影响1.有机溶剂对酶结构与功能的影响在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象；有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有的酶分子则保持完整；（1）有机溶剂对酶分子表面结构的影响：由于酶分子与溶剂的直接接触，酶分子表面结构发生变化；（2）有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：通过减少整个活性中心的数量，溶剂对酶的活性中心产生影响，活性中心数目丧失的多少取决于溶剂中的疏水性大小。Why？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性，影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力。（1）有机溶剂对结合水的影响一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水而导致酶失活。酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参数有关。由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。2.有机溶剂对酶活性的影响（2）溶剂属性(极性)与酶活力的定量关系酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；研究最多的是酶活力与溶剂极性参数lgP之间的关系；P：指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数，lgP越大，极性越小；Laane的实验发现：lgP2的极性溶剂中，由于溶剂极性强，易夺取酶分子表面水层而降低酶的活力。lgP4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想。2lgP4，酶活力中等。３、有机溶剂对底物和产物分配的影响溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；②有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低；故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为宜。第三节酶在有机介质中的催化特性有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平衡,从而影响到酶的结合部位.有机溶剂会改变底物存在状态.结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选择性,区域选择性和化学键选择性.一、底物专一性有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变;水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用;有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;①N-乙酰-L丝氨酸乙酯②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性:②﹥①介质水辛烷蛋白酶②﹥①①﹥②水解速度底物底物专一性(续)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反应;极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反应;①N-乙酰-L丝氨酸乙酯②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性:②﹥①二氯甲烷吡啶枯草杆菌蛋白酶①﹥②+丙醇(极性较强)底物介质反应速度②﹥①二、对映体选择性（enantioselectivity)又称立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标；立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强立体选择系数：有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化而发生改变。酶在水溶液中立体选择性强，疏水性强的有机溶剂中的酶的立体选择性差。这种选择性是由底物的两种对映体把水分子从酶分子疏水结合位置换出来的能力不同；介质的疏水性加大，L型底物置换水的过程在热力学上不利。原因溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性，如Ottolina报道一些脂肪酶、蛋白酶在（R）-香芹酮及（S）-香芹酮中立体选择性不同；对映体选择性意义：蛋白酶在水溶液中对L-氨基酸起作用，而在有机介质中可用D-氨基酸为底物合成手性药物，有重要应用。三、区域选择性（regioselectivity）酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应；用区域选择系数Krs的大小衡量。与立体选择系数相似，用1、2代替构型；反应的位置选择因子：K1，2=（kcat/Km)1/（kcat/Km)2例：1,4-二丁酰基-2-辛基苯丁醇脂肪酶转脂反应+甲苯乙腈K4，120.5四、键选择性（chemoselectivity)即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶反应，酶对其一优先反应；6-氨基-1-己醇黑曲霉脂肪酶毛霉脂肪酶羟基酰化氨基酰化占优意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；五、热力学稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有关；原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；Klibanov和Volkin认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。六.pH值特性有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的PH，pH记忆，pH印记;现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的PH密切相关，反应的最适PH接近于水溶液中的最适PH原因：在有机溶剂中酶分子表面的必需水只要在特定的PH和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能处于最佳的离子化状态检测：根据缓冲液中磷原子的核磁共振谱的变化核利用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冷冻干燥或有机溶剂沉淀后，