Takara说明书

研究用CodeNo.RR047A说明书PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)v201405Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●试剂盒外必备材料1●保存1●特长2●使用注意2●操作方法2●RealTimePCR4●实验例6●附录7●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但TotalRNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对TotalRNA样品进行DNaseI处理，以除去残存的基因组DNA。而DNaseI处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser是可以除去基因组DNA进行RealTimeRT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNAEraser，通过42℃，2min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNAEraser处理后的样品可以直接进行15min的反转录反应合成cDNA，因此，20min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。使用本制品合成的cDNA适用于SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）、PremixExTaq（ProbeqPCR）等定量试剂组合使用。注意：TakaraBio使用SYBR®GreenI作为研究试剂已得到MolecularProbesInc.的许可。SYBR®为MolecularProbesInc.的注册商标。●制品内容（20l反应×100次）1.gDNAEraser100l2.5×gDNAEraserBuffer*1200l3.PrimeScriptRTEnzymeMixI*2100l4.5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）*3400l5.RTPrimerMix*4400l6.RNaseFreedH2O1ml×27.EASYDilution（forRealTimePCR）*51ml*1：5×gDNAEraserBuffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。*2：含有RNaseInhibitor。*3：含有dNTPMixture。*4：含有OligodTPrimer和Random6mers。*5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TEBuffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASYDilution也可以单独购买（CodeNo.9160）。注意：EASYDilution请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。●试剂盒外必备材料热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块）反转录反应所用0.2ml和1.5ml的微量反应管微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。-1-●特长1．含有去除基因组DNA的gDNAEraser，只需2min即可除去基因组DNA。2．只需15min即可高效合成RealTimePCR反应用模板cDNA，是进行2StepRealTimeRT-PCR反应的最佳试剂。3．反转录引物使用了Random6mers和OligodTPrimer混合的RTPrimerMix，可以均匀合成样品中的各种cDNA。4．本制品提供了SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选择体系。SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法区别如下：反转录反应中RTPrimerMix的用量。反转录反应中总RNA的用量。5．RealTimeRTPCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA稀释到较低的浓度。如果用水或TEBuffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASYDilution（forRealTimePCR），将TotalRNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix；其中包括RNaseFreedH2O、Buffer、酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。2．gDNAEraser和PrimeScriptRTEnzymeMixI在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不要使Tip插入液面过深，否则会因Tip壁粘着造成损失，而使酶量不足。3．5×gDNAEraserBuffer和5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）在使用前需Vortex振荡混匀，轻轻离心后使用。4．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。●操作方法1.去除基因组DNA反应按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。试剂使用量5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA*1RNaseFreedH2Oupto10μl42℃2min（或者室温5min*2）4℃*1：20μl反转录反应体系中，SYBR®GreenqPCR法最多可使用1μg的TotalRNA，TaqMan®ProbeqPCR法最多可使用2μg的TotalRNA。*2：室温反应时，可以延长至30分钟。-2-2.反转录反应反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装10μl到每个反应管中*3。轻柔混匀后立即进行反转录反应。SYBR®GreenqPCR法试剂使用量步骤1的反应液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix*41.0μl5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）4.0μlRNaseFreedH2O4.0μlTotal20μl*537℃15min*685℃5sec4℃*7TaqMan®ProbeqPCR法试剂使用量步骤1的反应液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix*44.0μl5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）4.0μlRNaseFreedH2O1.0μlTotal20μl*537℃15min*685℃5sec4℃*7*3：若不配制MasterMix，向步骤1的反应液中添加试剂时，要先加入RNaseFreedH2O和5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)混合均匀，以使gDNAEraser的活性充分受到抑制，再添加RTPrimerMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI，轻轻混匀进行反转录反应。*4：使用RTPrimerMix可以高效合成cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用RTPrimerMix，而选择OligodTPrimer或GeneSpecificPrimer进行反转录反应，引物使用量如下：OligodTPrimer50pmol／20μl反应体系GeneSpecificPrimer5pmol／20μl反应体系*5：反转录体系可以根据需要相应扩大。*6：使用GeneSpecificPrimer时，建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。*7：合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。注意：1)在反转录反应中，SYBR®GreenqPCR法的RTPrimerMix用量为1μl，TaqMan®ProbeqPCR法的用量为4μl。2)得到的RT反应液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，其加入量不要超过RealTimePCR反应体积的1/10（V/V）量。-3-MasterMix10μlMasterMix10μl●RealTimePCR以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（CodeNo.RR820A/B）进行RealTimePCR反应的操作方法。采用TaqMan®探针法进行检测时，请选择PremixExTaq（ProbeqPCR）（CodeNo.RR390A/B）。◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1RT反应液（cDNA溶液）2μl*2dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2建议在25μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30-60秒Stage3：Dissociation◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3.实验结果分析反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。-4-◆应用AppliedBiosystems7300/7500RealTimePCRSystem的操作方法按仪器使用说明书要求进行实验操作（LifeTechnologies）。1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度SYBR®Pr