生物技术药物质量控制

生物技术药物质量控制李平生概述利用人体内的天然物质治疗人类的疾病或达到某种医学效果一直是医学上的一个重要研究领域。20世纪70年代以来产生了DNA重组技术，这种新技术是现代生物技术的主体，近年来首先在医药领域获得了飞速发展。生物技术的应用2/3用于医药，生物技术新型药物和疫苗已有50多种产品投放市场，400多种正在进行临床试验，2000多种在临床前研究。据报道，国外6500万人接受重组乙肝疫苗、100万人接受t-PA治疗，超过50万人使用EPO，每天约有1000万人接受重组人胰岛素的治疗。生物技术产品的生产和管理按生物制品的要求进行，不仅对最终产品的质量实施有效控制，而且特别重视对生产工艺的全过程进行质量控制,其中包括对每个生产步骤的验证、质量检定（QC）、质量保证部（QA）对生产和质量检定的全过程进行严格的管理。1、概念：2、分类｛生物技术药物重组DNA药物重组蛋白质药物采用DNA重组技术或其他新生物技术生产的治疗和预防药物。1、重组蛋白质或重组多肽药物包括：细胞因子类：rIFN、IL-2、EPO等；抗细胞素治疗：CD4可溶性受体等；重组溶血栓类：rSK、rSAK等；人源化单克隆抗体制剂；重组疫苗和菌苗制剂。2、重组DNA药物包括：寡核苷酸药物：反义核酸等；基因药物：腺病毒-IL-2、腺相关病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒-P53细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞DNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等。我国生物技术药物质量标准研究现状现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域产生了巨大影响。自1982年第一个基因重组药物—重组胰岛素上市以来，全世界约有60余种重组产品开发成功，包括基因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、反义核苷酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗。我国在“七五”、“八五”、“九五”期间国家“863”高技术项目支持下，先后建立一系列基因重组制品质量标准和质控方法，共完成国家一类、二类新药20余种产品的质量标准研究。生物技术药物质量标准研究的依据一、主要依照《重组DNA产品质量控制要点》、《中国生物制品规程》、《中国药典》等要求进行。二、参考世界卫生组织（WHO）和美国FDA颁布的指南、ICH文件和《欧洲药典》。检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行；保证产品安全、有效。生物技术药物质量标准研究的内容1、目标产品的均一性2、建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法3、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质控标准4、研究建立国家标准品或参考品5、建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标准6、制定出保证上述生物技术产品临床安全、有效、与WHO标准相一致的质量控制标准和规范化的检定方法重组产品质量控制上存在的难点建立重组药物的生物学活性测定方法；理化测定标准品的稳定性；人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究；重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评价反义核酸的体内及体外活力；基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物分布和效力测定；DNA疫苗的安全性和效力检测方法研究；干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及活力测定）。我国基因工程产品安全管理法规和技术指南《传代细胞系生产生物制品的规程》《人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点》《预防用新生物制品临床研究的技术要求》《人用重组DNA制品质量控制要点》《人的体细胞治疗申报临床试验指导原则》《人基因治疗申报临床试验指导原则》《药理毒理检查指导原则》《药品生产质量管理办法》《药品注册管理办法》生物技术药物的质量控制生物技术药物的特点：1、来源：活的生物体（细菌或细胞）；2、结构：复杂（包括组成、空间结构）；3、生产：涉及生物材料和生物学过程（发酵、细胞培养，分离纯化等），有其固有的易变性。生物技术药物的质量控制质量控制包括两个方面：1、生产过程中质量控制GMP（硬件、软件）2、最终目标产品的质量控制（方法学研究）质量控制方法学研究具体内容一、生物学活性测定和比活性二、蛋白质纯度检查三、蛋白质含量测定四、蛋白质药物理化性质的鉴定五、蛋白质的二硫键分析六、对糖蛋白的特殊要求七、残余杂质检查八、安全性及其他检测项目九、生物技术药物待测样品保存一、生物学活性测定和比活性1、意义：1）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽，其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成的活性中心所决定的，与其绝对质量不一致。2）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相一致。3）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。效价测定一般原则1、国际通用方法；2、测定结果须用国际或国家标准品校正，以国际单位表示。生物学活性测定方法分类1）体外细胞培养测定法a、促进细胞生长作用（G-CSF:NFS-60）b、抑制细胞生长作用(TNF:L929)c、间接保护细胞作用(IFN:VISH;VSV)2）离体动物器官测定法采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性。3）体内测定法4）生化酶促反应测定法5）免疫学活性测定法取兔离体动脉条剪成约1.5cm长、2～3mm宽的螺旋环，悬挂于含10mL通氧的37℃台氏液(取NaC18.0g、KC10.2g、CaCl20.2g、NaH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g、NaHCO31.0g、Glucose1.0g用蒸馏水配成1000mL的溶液，置于玻璃或塑料瓶中，用1mol·L-1NaOH溶液调pH至7.4)的麦氏浴槽中，加负荷1g，稳定1h，期间每20min换1次台氏液：连接多导记录仪，调节灵敏度，记录血管的张力变化。待张力曲线基线稳定后，加入1.25mg·mL-1盐酸去氧肾上腺素溶液0.05mL于麦氏浴槽中使其终浓度为6.25×10-5mg·mL-1，曲线升高至最高并稳定后，开始按累计浓度给药法(曲线稳定后对倍增加样品浓度为：6.25×10-5～8.0×10-2RU·mL)加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定1h，期问每20min换1次台氏液。待基线稳定后，按测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下式计算样品效价：样品效价=对照品效价×样品半效稀释倍数／对照品半效稀释倍数生物学活性测定方法选择体内测定和体外测定方法a、体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择体外测定方法。b、体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。生物学活性测定方法选择2、定量、半定量、定性方法a、通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、可重复的剂量-反应曲线；其次考虑半定量方法（如NGF），最后考虑定性（如BMP）方法。b、对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用HPLC定量方法代替复杂生物活性测定方法）。细胞培养法中细胞染色标记方法3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖细胞数的比例的。BrdU：首先用BrdU做标记，固定细胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗体发生反应。MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物MTTformazan,二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法测定MTTformazan的量可以反映线粒体电子传递系统机能，间接表示细胞的生长状态。AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。Crystalviolet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。几种细胞培养测定方法比较3H-thymidineBrdUMTTAlamarBlue靶向物DNA合成系统线粒体电子传递系统检出细胞的状态增殖增殖、生存检出法放射活性色素、荧光色素色素、荧光抽出的必要性+++-其他试剂的必要性++++-成本（以MTT为1时）6080-100（试剂盒）12缺点使用同位素不适合检出大量未增殖检出未增浮游细胞细胞，处理时费力殖活细胞生物学活性测定分析方法1、用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量为1单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。活性标准品待测样品稀释度abA值生物学测定基本模式图蛋白质药物的比活性测定的意义1、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。2、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。3、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。4、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。生物活性测定标准范围确定1、使用验证过的测定和分析方法，并提供用此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的可信限范围。2、对于成品的生物活性测定标准，要根据不同方法的特点规定相当标示量的范围，目前，生物活性的测定方法有四类：动物基础、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受体）结合法。不同生物活性测定方法的规定标准表测定方法规定标准动物基础的生物活性测定70%～130%标示量细胞基础的生物活性测定80%～120%标示量体外酶法的生物活性测定85%～115%标示量受体结合的生物活性测定85%～115%标示量生物学活性效价测定过程中标准品的作用1、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一的标准。2、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间和各种影响测定因素地干扰。二、蛋白质纯度检查1、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重要指标之一。2、按WHO规定必须用HPLC和非还原SDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上，有的甚至要求达到99%以上。3、纯度的检查通常是在原液中进行。4、方法：非还原SDS-PAGE电泳法、HPLC法、毛细管电泳。非还原SDS-PAGE电泳法：1、银染加样量≥5ug（1～10ng）2、考马斯亮蓝R-250加样量≥10ug（100ng）结果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的95%或98%。蛋白质样品在荷质比均一。HPLC法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与SDS-PAGE原理不同的反相或离子交换层析，不主张用分子筛分析。毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。几种检定重组蛋白纯度方法的比较特性HPLCSDS-PAGE、IEFCE分离机制极性、非极性分配，电荷、等电点电荷等分子大小、离子交换分析所需时间10～120min几小时10～30min分辨力好好好样品体积10～50ul1～50ul1～50nl灵敏度范围ng～ugng～ugpg定量准确性+±+分析方式紫外、荧光、折射紫外（可见、荧光）同HPLC电化学、放射性银染、放射自显影仪器价格中～高低中～高日常消耗低高低自动化中～高低中～高人力操作低高低制备级中中微量级制备收集样品可以可以较困难用于研究蛋白质纯度的方法和机制方法分析机制反相HPLC疏水性疏水性相互作用HPLC疏水性毛细管电泳荷质比离子交换HPLC电荷等电聚焦电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷比SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷，分子大小分子排阻HPLC分子大小质谱测量法分子大小三、蛋白质含量测定1、此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。2、可根据物理化学性质采用Fo