荧光定量PCR技术讲座

荧光定量PCR技术讲座------分子生物学实验技术系列讲座Ⅲ张志坤2010、09、10大纲一、荧光定量PCR技术的基础理论二、引物及Taqman探针的设计三、内参基因的选择四、反应体系的优化五、实验方案的选择六、误差分析及操作规范七、实验中污染的防控八、实验结果的分析一、荧光定量PCR技术的基础理论1、荧光定量PCR技术概论荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。一、荧光定量PCR技术的基础理论1、荧光定量PCR技术概论荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线、阈值、CT值（1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念（2）、阈值线在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。一、荧光定量PCR技术的基础理论2、荧光定量PCR常用的三个概念（3）、CT值PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础荧光定量PCR是随着PCR循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点：（1）、本底低（2）、荧光强度高（3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系（4）、没有PCR产物时，没有荧光（5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种荧光不会产生荧光的交叉干扰一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础目前常用的几种荧光物质（1）、Taqman探针类5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础Taqman常用的荧光基团和淬灭基团荧光基团：5’端常用荧光基团FAM标记，最佳激发光波长：494-495nm，最大发射光波长：518-520nm。淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500—560nm，最佳激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生的发射光具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560—650nm，当做多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已不常用。BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较为常用，尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础Taqman探针的特点及应用（1）、特异性强、准确性高本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCR产物的量成正比关系，因此准确性极高。（2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的Taq酶就能满足实验的要求。（3）、常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝)及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变化）。（4）、目前价格也不是太贵，2OD1000.00左右一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础（2）、荧光染料类目前常用的荧光染料为SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、SYTO9、HRM等。其共同性质为：（a）、结合于双链核酸的小沟处（b）、与双链DNA结合后受激产生荧光（c）、在变性条件下双链分开，荧光消失一、荧光定量PCR技术的基础理论3、荧光定量PCR的化学基础荧光染料的特点及应用（1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；（2）、可做双链核酸的熔解曲线分析；（3）、SYBRGreenⅠ染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStarTaq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；（4）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；（5）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（6）、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。一、荧光定量PCR技术的基础理论4、荧光定量PCR的数学原理对于普通的PCR反应来说nXn=X0（1＋E）上式中，Xn为n轮PCR循环后，目的基因PCR产物的量；n为PCR循环数；X0为目的基因的初始模板量，E为PCR的反应效率，0≤E≤1。一、荧光定量PCR技术的基础理论4、荧光定量PCR的数学原理由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成正比，所以用荧光强度来代替PCR产物的量，我们可以得到：Rn=RB+X0(1+E)Rsn总荧光信号强度=本底信号+分子数量×单位信号强度Rn：第n个循环时的总信号RB：本底RS：单位信号强度X0：起始DNA数目E：PCR效率一、荧光定量PCR技术的基础理论4、荧光定量PCR的数学原理当循环数n等于CT值时，所有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都达到了阈值。RT=RB+X0(1+E)Rslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs此时，PCR反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率E稳定且近似相等；lg(RT-RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0为变量，且这两个变量之间成一次性方程。也就是说，所有样品的lgX0与到达阈值时的循环数n（Ct值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量CT一、荧光定量PCR技术的基础理论5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析CTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs（1）、PCR效率相等，在PCR扩增的指数期，E稳定且为常数；（2）、RT–RB要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧光本底之差要相等；（3）、样品的单位信号强度Rs要相等，用荧光染料做荧光基团时，Rs就是每条PCR产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和PCR产物的长短有关，PCR产物越长，结合的荧光染料越多，Rs值越大；用探针做荧光基团时，Rs就等于PCR反应时，Taq酶水解掉探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和PCR产物的长度没有直接关系。一、荧光定量PCR技术的基础理论5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn，改图反映的是各个样品随着每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值RT–RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的RT–RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。一、荧光定量PCR技术的基础理论5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。一、荧光定量PCR技术的基础理论6、双链核酸的熔解曲线分析使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCR反应的进行，双链PCR产物呈指数增长，SYBRGreenⅠ与双链PCR产物结合后荧光越来越强，当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCR产物进行缓慢加热，从50℃一直加热到99℃，在此过程中PCR产物按照TM值的大小双链被依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：一、荧光定量PCR技术的基础理论6、双链核酸的熔解曲线分析对于核酸序列相同的PCR产物，其TM值也相同，而且其TM值在一个很小的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：一、荧光定量PCR技术的基础理论6、双链核酸的熔解曲线分析上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的TM值。核酸双链的TM值由双链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TM值也不同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线是根据双链核酸的TM值来分析的，这与琼脂糖电泳及SSCP有异曲同工之处。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、绝对定量和相对定量一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNA提取时得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-deltaCt法。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析（1）、双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。双标准曲线法的特点：（a）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误差；（b）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行反复的优化；（c）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；（d）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。一、荧光定量PCR技术的基础理论7、mRNA差异表达的相对定量分析（2）、2-△△CT法该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。二、引