第四节 微生物细胞工程

第四节微生物细胞工程•微生物是一个相当笼统的概念，既包括细菌、放线菌这样微小的原核生物，又涵盖菇类、霉菌等真核生物。•由于微生物细胞结构简单，生长迅速，实验操作方便，有些微生物的遗传背景已经研究得相当深入。•现已在国民经济的不少领域，如抗生素以及其他发酵工业、污染防治与环境保护、灭虫害与农林发展、深开采与贫矿利用、资源保护与能源再生、种菇蕈造福大众等方面发挥了非常重要的作用。第四节微生物细胞工程•微生物细胞工程是指应用微生物细胞进行细胞水平的研究和生产。•具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改变、微生物细胞的直接利用以及获得微生物细胞代谢产物等。•本节仅从细胞工程的角度，概述通过原生质体融合的手段改造微生物种性、创造新变种的途径与方法。第四节微生物细胞工程一微生物细胞融合二原核细胞的原生质体融合三真菌的原生质体融合四微生物细胞工程研究进展一微生物细胞融合•早在1958年，冈田善雄发现，用紫外线灭活的仙台病毒可以诱发艾氏腹水瘤细胞融合产生多核体。•微生物细胞壁是细胞融合的一道天然屏障，要使不同细胞遗传信息发生重组就需要除去细胞壁。不少人尝试制备微生物原生质体。一微生物细胞融合•1972年，匈牙利Ferernczy等首先报道在微生物中的原生质体融合，他们采用原生质体融合技术使白地霉营养缺陷型形成强制性异核体。•1976年巨大芽抱杆菌、枯草杆菌、裂殖酵母等原生质体融合取得成功，构巢曲霉和烟曲霉、娄地青霉和产黄青霉等真菌种间原生质体融合也获得成功。（一）微生物细胞融合工艺菌种选择扩大培养大量菌体细胞①高渗溶液(SMM液、DP液)②脱壁酶(蜗牛酶、溶菌酶)原生质体融合剂(PEG)原生质体融合去融合剂融合原生质体培养基细胞壁再生菌落繁殖融合体筛选（二）影响微生物细胞融合的因素•微生物原生质体融合受下列因素的影响：•①参与融合菌株的遗传性状。•参与融合的菌株一般都需要有选择标记，标记主要通过诱变获得。在进行融合时，应先测定各个标记的自发回复突变率。若回复突变率过高，则不宜作为选择标记。•②制备原生质体的菌龄。•制备细菌原生质体应取对数生长中期菌龄的细胞，因为此时的细胞壁中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。（二）影响微生物细胞融合的因素•③培养基成分。•细菌在不同的培养基中培养对溶菌酶的敏感程度不一。培养用基本培养基比用完全培养基效果更好。•④细胞的前处理。•由于细胞壁结构的差异，同样是革兰氏阳性菌，对溶菌酶的敏感程度也不一样。芽孢杆菌对溶菌酶的敏感性大于棒状杆菌。在棒状杆菌制备原生质体前，菌体前培养需要添加少量青霉素以阻止肽聚糖合成过程中的转肽作用，从而削弱细胞壁对溶菌酶的抗性。二原核细胞的原生质体融合•细菌是最典型的原核单细胞生物，细胞外有一层成分不同、结构相异的坚韧细胞壁，形成抵抗不良环境因素的天然屏障。•根据细胞壁成分的差异将细菌分成革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两大类。•前者肽聚糖约占细胞壁成分的90％，而后者的细胞壁上除了部分肽聚糖外还有大量的脂多糖等有机大分子。由此决定了它们对溶菌酶的敏感性有很大差异。二原核细胞的原生质体融合•溶菌酶广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中。它能特异地切开肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，从而使革兰氏阳性菌细胞壁溶解。•由于革兰氏阴性细菌细胞壁组成成分的差异，处理革兰氏阴性菌时，除了溶菌酶外，一般还要添加适量的EDTA(乙二胺四乙酸)，才能除去它们的细胞壁，制得原生质体或原生质球。（一）PEG融合示意图（二）G+细胞融合的过程•①分别培养带遗传标志的双亲本菌株至细胞壁最易被降解指数生长中期；•②分别离心收集菌体，用高渗培养基制成菌悬液，以防止下阶段原生质体破裂；•③混合双亲本，加适量溶菌酶，作用20~30min；•④离心后得原生质体，用少量高渗培养基制成菌悬液；（二）G+细胞融合的过程•⑤加入10倍体积的PEG促使原生质体凝集、融合；•⑥数分钟后，加入适量高渗培养基稀释；•⑦涂接于高渗选择培养基上进行筛选。•长出的菌落很可能已结合双方的遗传因子，要经数代筛选及鉴定才能确认已获得能稳定遗传的杂合菌株。（三）G-细胞融合的过程•革兰氏阴性细菌，在加入溶菌酶数分钟后，应添加0.1mol/L的EDTA-Na2共同作用15~20min，则可使90％以上的革兰氏阴性细菌转变为可供细胞融合用的球状体。•尽管细菌间细胞融合的检出率仅在10-5～10-2之间，但由于菌数总量十分巨大，检出数仍是相当可观的。三真菌的原生质体融合•真菌主要包括单细胞的酵母类和多细胞菌丝类。•降解真菌细胞壁、制备原生质体是融合的关键。•真菌的细胞壁成分较复杂，主要由几丁质及各类葡聚糖构成纤维网状结构，夹杂着少量的甘露糖、蛋白质和脂类。•因此可在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入消解酶进行酶解，也可用蜗牛复合酶进行处理，原生质体的得率都在90％以上。此外还有纤维素酶、几丁质酶、新酶等。三真菌的原生质体融合•真菌原生质体融合的要点与前述细胞融合类似，多以PEG为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合子。•但真菌多为单倍体，只有形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代；杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳定，需经多代考证才能最后断定是否为真正的杂合细胞。三真菌的原生质体融合•（一）酵母的原生质体融合•（二）霉菌的原生质体融合融合技术要点（一）酵母的原生质体融合（一）酵母的原生质体融合（一）酵母的原生质体融合（二）霉菌的原生质体融合•简要介绍霉菌（丝状真菌）原生质体融合的基本方法，种内和种间原生质体融合和融合产物的生化遗传分析，以及原生质体融合在工业上的应用。•1.霉菌原生质体融合方法•2.种内原生质体融合1.霉菌原生质体融合方法•（1）亲株的选择和标记：•由于原养型亲株特性的多样化，选择不同特性的亲株进行融合很有必要，例如：选择一株高产(或优质)、孢子形成率少或生长速率缓慢；与另一株低产(或劣质)、孢子形成率多或生长速率快的两菌株进行融合，很有希望获得高产(或优质)和孢子形成率多或生长快速的融合产物。•融合亲抹的标记，对检出融合产物及其精确的遗传分析是必不可少的。常用的选择性标记，有营养缺陷和药物抗性非选择性标记，有菌落形态、孢子颜色和特定代谢产物的量或质等。（2）原生质体的分离、再生和回复•①原生质体分离：•对数生长早期的菌丝体，置于添加外源溶菌酶的高渗稳定剂溶液中酶解脱壁，分离并纯化原生质体。•例如有效溶解产黄青霉或顶头孢霉的菌丝壁的多糖酶——纤维素酶、蜗牛酶、溶解酶L1等，用量为在0.1%~1.0%之间，于30~33℃处理1~4小时；用0.7M氯化钠或0.6M硫酸镁作高渗溶液稳定保护原生质体。•在此高渗稳定溶液中酶解脱壁，通常可获得高产率的原生质体。（2）原生质体的分离、再生和回复•②原生质体再生：•所谓再生，即脱壁的球状原生质体，在高渗稳定的再生培养基上，于培养过程中生长细胞壁，并形成菌丝或菌落。（2）原生质体的分离、再生和回复•③灭活原生质体融合：•用热、药物和紫外线处理，使一方或双方都灭活的原生质体进行融合。用产黄青霉的一方原生质体融合前先经紫外线照射灭活后与另一方活的原生质体融合，可提高其融合频率5~10倍。•推测紫外线灭活原生质体一方或双方，诱导遗传物质的单向传递或是致死损伤互补，而紫外线照射是否能引起附加突变而影响遗传分析，这些问题至今未见报道。（2）原生质体的分离、再生和回复•④原生质体与脂质体融合：•青霉素产生菌突变阻断三肽前体的生物合成，这种不产生青霉素突变型原生质体，与包裹着α-三肽的脂质体相混合，用PEG诱导融合，融合产物可产生较大量青霉素。•脂质体可作为遗传物质和其他生物活性化合物或代谢中间物的载体，通过与原生质体融合而传递。（2）原生质体的分离、再生和回复•⑤融合产物的选择：•间接选择法是将融合原生质体涂布于CM上生长，再影印于MM或选择性MM上，由于多数融合原生质体在核融合前就发生分离，成为两亲株标记的分离子，少数菌落即为异核体并长成二倍体。（2）原生质体的分离、再生和回复•直接选择法是将融合原生质体直接接种在MM或选择性MM上，形成异核体，体内核迁移融合形成二倍体，用理化因素处理二倍体孢子，发生核分离和重组，生成包括重组体在内的高频率分离子，对重组分离子的细胞大小，核数目和DNA含量，形态以及分离子标记进行签定和分类。2.种内原生质体融合•（1）异核体形成：•营养标记互补的原生质体融合，导致异核体形成。异核体产量取决于融合频率，Ca(NO3)2或CaCl2和低浓度PEG于pH则可获得优良结果。•异核体发展产物有以下几种。•①形成异核体和偶见的稳定二倍体——曲霉和青霉属的一些种是这种异核体的典型代表。•②形成异核体和常见的短暂二倍体——顶头孢霉在原生质体融合中容易产生高频率的异核体，但异核体极不稳定，只分离到极少数杂合原养型茵落，二倍体阶段相当短暂，迅速发生染色体分离；赤霉素产生菌具有类似情况。（2）原生质体融合和重组•原生质体融合有低频率的自发融合和高频率的诱发融合，两者相差几个数量级。诱发融合是以等量原生质体相混合，以CaCl2作高渗稳定溶液(pH为7)，用PEG融合，取样镜检，达到最高融合率时，离心洗涤除去大部分PEG-Ca2+。•融合原生质体接种到MM或选择性MM平板上再生和回复成为正常细胞。（3）原生质体回复•细胞壁合成后立即发生细胞分裂，分裂几代后，才能回复成为正常细胞形态。•形态多样化取决于各自细胞分裂方式。当细胞分裂受到干扰时，会出现各种畸变形态的细胞；不受干扰的细胞分裂，将回夏成为正常细胞。•所有回复体细胞都能保持稳定的传代。•不论近亲或远亲的种间原生质体融合，其频率比种内约低5个级数。融合产物及其性质可能有下列几种情况：•①形成异核体和二倍体：构巢曲霉和皱孢曲霉，其融合产物表现为构巢曲霉种内融合产物的各种特性。•②形成异核体和异倍体：•首先形成异核体，异核体状态稳定，继则核融合。娄地青霉和产黄青霉融合可得到三种生长缓慢的原养型菌落，第一种菌落形态正常，在CM上有选择地产生营养缺陷的娄地青霉孢子；第二种菌落是由松散网状菌丝组成的异常形态，在CM上亦产生营养缺陷的娄地青霉孢子。第三种菌落，在MM上形成大的原养型孢子。•而用产黄青霉培养条件的三种菌落都能产生与产黄青霉产生一祥的青霉素，第一和第二种菌落是异核体，第三种菌落是异倍体或部分异倍体。•③形成部分异倍体：•构巢曲霉和烟曲霉融合，种间融合频率比种内至少低5个级数。异核体或完全异倍体状态极短，故分离不到，异核体或二倍体状态可能是致死的。互补细胞内含有亲株一方的完整基因组和另一方的少数染色体，是部分异倍体。在MM上用菌丝或孢子传代可以长期保持。但在CM上的互补细胞迅速分离为构巢曲霉或烟曲霉，但双方同不会同时出现。•至今国内外已成功地进行过诸多真菌的种内、种间、属间的原生质体融合，多为大型食用真菌，如蘑菇、香菇、木耳、凤尾菇、平菇等，取得了相当可观的经济效益。四微生物细胞工程研究进展与应用•（学生综述）思考题•1微生物细胞工程的主要研究内容•2微生物细胞融合工艺