-定性免疫学检验的性能验证与质量控制

牛广华定性免疫学检验的性能验证与质量控制ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心ISO15189认可中大家到困惑的问题定性免疫项目如：ELISA检测、自身抗体免疫印迹试验、抗核抗体免疫荧光（IIF）检测质量控制和性能验证及验证内容？如何做？标准？ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心5.5.1.1检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少应包括：检出限、符合率（采用国家标准血清盘或临床诊断明确的阴阳性样品各20份或与其他分析方法比对），如为定量方法应验证精密度（包括重复性和中间精密度）；并应明确检验项目的预期用途，如筛查、诊断、确认。5.5检验程序CNAS-CL39：2012《医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学检验领域的应用说明-2014改版ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„试剂盒说明书（先决条件！）„国际和／或国内标准性能验证的合格标准从何而来？ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„筛查试验„诊断试验„确认实验„C50„C5„C95概念准备ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„筛查试验用于检测整个人群或部分人群中分析物的存在情况。„一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑。如粪便隐血检测、梅毒血清学试验筛查试验ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„用于临床怀疑某种特定疾病或状况是否存在。„诊断试验需具有良好的敏感性和特异性。„诊断试验后如需进行确认试验，对诊断试验的特异性要求可以稍微降低。如各种微生物培养诊断试验ISO15189实验室认可系列培训讲座„确认试验用于验证筛查试验或者诊断试验结果的确认。„对于确认试验，特异性比敏感性更为重要。如梅毒密螺旋体抗体荧光吸收试验（FTA-ABS）辽宁中医药大学附属医院临床检验中心确认试验ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。临界点（C50）浓度的定义C50ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„这里的C50指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓度，其一旦确定，是不变的。„试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号值，每次测定都会有所差异。C50与试剂盒阳性反应判断值（CUT-OFF值）的区别ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性结果时该分析物的浓度。C5浓度的定义C5ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳性结果时该分析物的浓度。C95浓度的定义C95ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„应熟悉待验证的试剂或系统„进行必要的培训，包括样本的处理和储存、试剂的处理和储存、合理的检测方案、对结果合理的解释以及系统的质量控制等。„制定质量保证计划„确定患者样本的数量及强弱（评价重复性）„确定比较的方法性能验证专业知识技能准备ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„质控品：可为商品质控品，有阳性和阴性。„C50和可能的C5（低于C50浓度20%）及C95浓度样本（高于C50浓度20%）：用于重复性及昀低检出限验证，不少于40次检测量）„临床样本或血清盘（准确性验证）（不少于50份阳性和阴性样本）样本准备ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„进行重复性研究时，理想情况下需绘制在规定条件下候选方法的整个不精密度曲线，然而具体操作时需要检测的样本数量较大„可使用一个简单的方法，即为待评价的检测方法建立分析物的临界浓度，并判定某一特定浓度范围，例如C50±20%，是否包含了C5-C95区间。„若-20%到+20%浓度范围包含了C5-C95区间，那么20%或距离C50更远浓度的样本将得到一致的检测结果，即在C5-C95区间之外的样本检测结果可认为是精密的，浓度C95，将持续得到阳性结果，浓度C5，将持续得到阴性结果。±20%仅用于举例，实验室也可根据检验目的和可接受的精密度选择±10%或±30%。分析物浓度接近C50的定性方法精密度试验ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„评价定性检测试剂或系统精密度时，需采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。„定性测定精密度分析质量指标为C5-C95浓度区间（亦即“灰区”），这一区间范围≤C50±20%。只提供两种检测结果(-/+)的定性检测的精密度ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心两种不同方法的不精密度曲线比较ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„检测试剂或系统的说明书可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。„如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50%阳性和50%阴性结果的那个稀释度。这一稀释度的分析物浓度即为临界点（C50）。如何获得系统或试剂的“临界点（C50）”CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuidelineISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心C50是否准确？40次测试C50=13/40(32.5%)1阳性结果=27/40(67.5%)不正确2阳性结果（14-26）/40（35%-65%）正确ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心不同C50重复检测次数与检出阳性数的关系ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心如何获得系统或试剂的“临界点（C50）”ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„制备评价用样本制备3份样本。一份浓度为C50，一份为C50+20%，一份为C50-20%。每份样本的体积需保证40次或更多次重复检测的需要。„评价方法每份样本检测40次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。试验步骤ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心-20%～+20%浓度范围在C5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过C50±20%的样本检测结果不一致；此结论错误率5%，需使用更宽浓度范围的样本（如±30%）进行另外的试验。结果判断-1ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心-20%～+20%浓度范围包含了C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过C50±20%的样本检测结果一致结果判断-2ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心用该方法检测，C50+20%的样本检测结果一致，C50-20%的样本不一定能得到一致结果；需要用低于C50更大百分率浓度的样本（如-30%）进行补充试验。结果判断-3ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+30%）进行补充试验。结果判断-4ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„检测限（limitofdetection）是指检测方法可检测出的昀低被测量浓度，也称检测低限（lowerlimitofdetection）或昀小检出浓度（minimumdetectableconcentration），有时也称为分析灵敏度（analyticalsensitivity）。„如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以测出的昀低被测量浓度。检出限的验证ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„评估试剂分析敏感性所使用的样本，如检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质，或与国际标准物质溯源的样本，是更有意义的。„处于测定下限浓度（如C95）的样本，重复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。检出限的验证ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心概述特定的定性免疫测定系统或试剂的准确度以与临床诊断、金标准方法和经过验证确认血清样本盘的检测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符合率来表示。准确度验证ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率（即出现阳性结果和确定患者患病）；注：该临床疾病必须由不依赖于被评价试验的标准确定。„临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。临床特异性和临床敏感性ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心研究人群有一些研究的人群，仅包括健康人群和疾病严重的人群，而忽略了介于两种状态之间的人群和一些不典型的患病人群。将这部分人群剔除在研究人群之外，会优化评价的结果，造成试剂在实际应用当中结果简单明确的假象。因此，研究人群昀好符合以下要求：——涵盖疾病的各个阶段；——涵盖一些不典型的、较难诊断的患病人群；——各组不同特征的人群均需有一定的数量。总之，研究的人群要能够代表该检测系统或试剂预期使用的人群，否则给出的数据将存在偏倚。临床特异性和临床敏感性ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心试剂的检测结果分析物阳性分析物阴性共计阳性结果数TPFPTP+FP阴性结果数FNTNFN+TN共计TP+FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性×100%特异性×100%阳性预测值×100%阴性预测值×100%符合率×100%注1:式中：TP—分析物存在时检测结果为阳性的数量。FP—分析物不存在时结果为阳性的数量。TN—分析物不存在时检测结果为阴性的数量。FN—分析物存在时检测结果为阴性的数量。FNTPTP+FPTNTN+FPTPTP+FNTNTN+FNTNFPTPTPTN++++表1:敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心„作为筛查试验，检测的敏感性应95%。作为诊断试验，检测敏感性和特异性均应95%。作为确认试验特异性应98%-99%。定性免疫检验项目敏感性、特异性要求ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学附属医院临床检验中心建议使用计分可信区间以上公式中，1.96是从标准正态分布对应的95％可信区间得来的。若置信水平改变，则1.96也应被相应的百分位点所替代。ISO15189实验室认可系列培训讲座辽宁中医药大学