第九章 基因工程和基因组学-II

1第九章基因工程和基因组学第九章-I基因组学第九章-II基因工程2第九章-II基因工程一、基因工程的概念二、基因工程的四大要素及实施要点三、细胞工程3一、基因工程的概念�遗传工程（geneticengineering）是七十年代发展起来的一门新技术，它是综合分子生物学与微生物学、分子遗传学等理论和技术建立起来的。广义的遗传工程：基因工程、细胞工程、染色体工程和细胞器工程。狭义的遗传工程：基因工程41基因工程的概念：是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。这实际上就是目前讲的转基因技术。52.基因工程的优越性:传统杂交只能进行亲缘关系较近的交配（远缘交配失败），无法进行远缘交配（即遗传物质交流），遗传物质交流开始是全方位的，通过人为选择，可以达到目的性状，但工作量大，且容易改变原来的其他优良性状。6但基因工程就不同的，它不但可以进行种间、属间科间遗传物质交流，还可以进行高等、低等，动物与植物间遗传物质交流，同时可以定向而不改变原来的优良性状，所以十分诱人！目前基因工程主要在以下几方面应用：基因工程7a.生物制药b.遗传病治疗c.农业新品种选育d.发酵工程e.治理环境污染(创造微生物新类型)f.其他等基因工程83.基因工程施工的程序a.施工准备材料,即“目的”基因，载体和工具酶等。b.把目的基因与载体结合成重组DNA分子c.把重组DNA分子引入受体细胞，即基因转移，建立分子无性繁殖或称克隆。d.鉴定筛选转基因系基因工程9二、基因工程的四大要素及实施要点（一）基因的克隆（分离）1.鸟枪法（shotgun）这是基因工程初期使用的方法，曾起很大的作用。目前很少采用，但却在此方法基础上发展用来研究基因的功能等。鸟枪法具体做法是：DNA相当于基因大小的片段→与载体重组细菌→筛选所需的基因。限制性内切酶转化基因工程10（一）基因的克隆（分离）--方法和步骤●从基因库中分离基因●聚合酶链式反应（PCR）扩增基因●人工合成基因鸟枪法（shotgun）11二、基因工程的四大要素及实施要点（一）基因的克隆（分离）1.鸟枪法（shotgun）这是基因工程初期使用的方法，曾起很大的作用。目前很少采用，但却在此方法基础上发展用来研究基因的功能等。鸟枪法具体做法是：DNA相当于基因大小的片段→与载体重组细菌→筛选所需的基因。限制性内切酶转化122.化学合成1970年Khorana首次合成酵母丙氨酸tRNA的基因，1976年合成第一个有生物活性的基因，大肠杆菌酪氨酸tRNA的基因。基因工程13基因化学合成首先要了解该基因的核苷酸顺序，然后才能合成。要了解该基因的顺序，通常须将该基因克隆出来，而克隆出来的基因目前可通过更简便方法进行基因合成（克隆），即装入载体，转入细菌中合成或通过其他方法的合成。所以纯粹的基因合成目前少见，除非该基因拿不到！目前化学合成主要用来合成PCR引物等小片段。基因工程143.从基因库中分离基因步骤：(1)构建基因库(2)从基因库中筛选目的片段（3）目的基因的进一步分析与鉴定153.从基因库中分离基因(1)构建基因库基因库：核基因库染色体库cDNA库线粒体库16核基因库核基因库（genomiclibrary或genomicbank）是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的，理想的应包括全部的序列方法是（见p294\划线）一般的核基因库：BACYACTAC17染色体基因库基因组一部分（一根染色体）用来构建基因库.流动细胞分拣技术（flowcytometry）18cDNA库具有特异性193.从基因库中分离基因(2)从基因库中筛选目的片段一般的方法是利用一段已知与目的基因紧密连锁或已确定是目的基因一部分序列DNA片段。标记作为探针通过DNA互补杂交从基因库中筛选目的基因。举例：筛选入噬菌体构建的入噬菌体核基因库203.从基因库中分离基因（3）目的基因的进一步分析与鉴定一般情况获得目的基因片段是比基因本身长的，所以通常需要进一步亚克隆，采用的主要有图位克隆法，或称染色体步移。亚克隆出来后，还要进行测序和进一步鉴定。21举例一：从cDNA库中分离●cDNA：反转录DNA如果已知基因的特异mRNA，就可以直接利用该mRNA反转录cDNA（基因）。值得提出cDNA与原来的基因组的基因序列可能不一样，因为内含子不转录。DNA转录mRNA反转录cDNA基因工程2223●cDNA文库某一时期等组织基因转录形成mRNA总体反转录成cDNA，这些cDNA总体就称为cDNA文库。基因工程24转录总DNAmRNA反转录cDNA1cDNA2cDNA3cDNA文库……●从cDNA文库调基因的方法〇特异的探针（已知基因某些关键序列）〇缩减杂交法基因工程25举例二、从核基因组文库中分离●基因组文库：将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体、重组、克隆，所产生的克隆群体代表基因组DNA的所有序列。现在已构建的基因组文库主要有：基因工程26BAC(细菌人工染色体)，以细菌作为对象，将DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。YAC(酵母人工染色体)，以酵母作为对象。PAC(噬菌体人工染色体),以噬菌体作为对象。TAC(可转化的细菌人工染色体)MAC(哺乳类人工染色体)基因工程27细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）1、定义：指细菌的F因子经人工改造后成为100kb以上外源DNA片段的“大”质粒。2、特点：本身分子量小，pBeloBAC117.4kb在细菌内，自我复制（有限）具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点3、用途：用于构建植物的全基因组大片段基因库。2829酵母菌人工染色体（yeastartificialchromosome.YAC）1、定义：指酵母菌附加体质粒改造后，成为能携带100-1000kb外源DNA片段，“大”质粒。2、特点：在酵母菌中自主复制。具有选择标记基因和克隆位点。3031Ti质粒1、定义：是一种存在于革兰氏阴菌----根瘤土壤杆菌细胞中的细菌质粒。根瘤土壤杆菌———冠瘿瘤2、特点（1）有5个主要功能区域：T-DNA、质粒转移冠瘿碱代谢、复制原点（ori）毒性区域（vir）（2）3、Ti质粒的衍生载体双元载体、共整合载体。32334、聚合酶链式反应（PCR）扩增基因适用已知DNA序列的基因，或已知基因两端部分序列基因。具体方法见图34变性引物结合延伸3536(二)重组DNA的建立为了实现基因转移，首先需要限制酶将“目的”基因安装在一个特定的运载工具——载体DNA上，在载体DNA的运载和保护下，被转移的基因可以通过适当方法顺利进入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，最后整合到染色体上，达到稳定表达。基因工程371.运载工具●作为运载工具的条件〇在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地保存。基因工程38〇有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因，并能嵌入外源DNA的片段。〇具有可作为重组DNA分子选择标记遗传标记。基因工程39●原核生物载体的种类现在有多种载体，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。〇质粒载体：以细菌质粒（plasmid）的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。基因工程40质粒，环状DNA大小1kbp到200kbp。它们经改造后具有作为DNA运载工具所有的条件。基因工程41a.pBR322质粒，广泛应用。特征：（a）有36个单一的限制性内切酶位点，（EcoRⅠ，HindⅢ等）（b）四环素抗性基因Tetr。外源DNA片段插入到BamHI位点时，使Tetr失活，可以通过AmprTets来筛选重组体。基因工程42b.pUC18/19质粒c.pGEM系列多功能载体基因工程43基因工程444546●真核生物载体真核生物载体与原核的不一样。目前所用的大多是所谓的穿梭载体，它们应该具备如下条件：基因工程47〇含有原核基因的复制起始序列以及筛选标记〇含有真核基因的复制起始序列以及真核细胞筛选标记〇含有有效的启动子序列〇RNA聚合酶Ⅱ所需的转录终止和poly（A）加入的信号序列。〇合适供外源基因插入的限制性内切酶位点。举列：yeast-E.coli穿梭载体基因工程48基因工程49502.限制性内切酶细菌细胞对外来DNA具有防御，当DNA进入时，DNA会被一种特殊的酶（即限制性核酸内切酶）所毁灭，这个过程称做限制。这种限制性内切酶非常有用，它可以把大的DNA——小片段，也可以把运载工具—质粒切成适于携带基因或片段的状态，以便形成重组DNA分子。这是一次巨大的发现。基因工程51●类别第一群以EcoB、Ecok等为代表，能切断双链，切割部位没有特异性。第二群以EcoR1，HindⅢ（嗜血杆菌）等为代表，能切断双链，切割部位在DNA分子上有特定的碱基顺序，即切割部位具有特异性。基因工程52●EcoR1和HindⅢ的特点〇只在一定核苷酸顺序上起作用.〇多数可以产生粘性末端，即在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状DNA，因此称为粘性末端。基因工程53GAATTC…….GAATTCCTTAAG……CTTAAGEcoR1AATTC……….GG……...CTTAA粘性末端基因工程5455563.重组DNA分子的建立有了“目的”基因、载体DNA、限制酶，下一步是DNA的体外重组，就是把“目的”基因牢牢地安装在载体上，使它们共价连接。这就是DNA分子的重组。基因工程57DNA的重组主要是采用限制性内切酶法。同一种限制酶切割不同来源的DNA所产生的DNA片段，虽然区段和大小不同，但单链末端（粘性末端）的顺序和长短都一样。因此，不同来源的DNA片段，可以通过粘性末端对应碱基间的氢键集合到一起，再经DNA连接酶的作用，将切口接合起来，成为一个完整的重组DNA分子（图11-35）。基因工程58基因工程59（三）重组DNA的导入重组DNA的导入方法有多种1.转化或转染●转化：以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞。●转染：把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞。基因工程60这二种方法导入重组DNA关键的问题是要有感受态的细胞，即处于最适于摄取外源DNA的生理状态的细胞。目前创建感受态细菌的方法是让受体菌经一定浓度的冰冷CaCL2（50~100mmol/L）溶液处理一段时间。基因工程612.高压电穿孔法，即基因枪的方法方便，但必须有专门仪器。3.PEG(聚乙二醇)介导的原生质体转化法。4.磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染5.原生质体融合6.脂质体法7.细胞显微注射法基因工程62基因工程63（四）基因重组体的筛选1.利用质粒上特异的筛选标记进行特异筛选2.分子杂交筛选3.其他的方法基因工程64三、细胞工程1.体细胞杂交2.细胞核移植3.体配杂交(生殖工程)656667686970作业：P246：2，10