T细胞研究-BD

T细胞研究CD4+T细胞分化和可塑性的创新性多色流式细胞研究工具3T细胞研究是当今的热门研究，在所有研究这类淋巴细胞亚型特征的方法中，多色流式细胞术是很卓越的。同时，由于CD3+T细胞群在功能和形态学上的复杂性，使得多参数流式细胞术成为必不可少的、强有力的研究工具。二十多年来，研究者们利用BD的流式细胞产品在T细胞的研究上取得了众多进展。今天，借助BD生物科学平台、试剂、仪器和技术方案等研究手段不断涌现出许多有关T细胞的科学新发现。BD公司立志于继续开发新的、高品质的试剂以及试剂盒，包括IL-7F和T-bet单克隆抗体、Th17/Treg细胞表型试剂盒、调节性T细胞分选试剂盒、Th1/Th2/Th17CBA试剂盒和BDPhosflow™T细胞活化试剂盒等。T细胞亚型可根据细胞表达的表面标志物和转录因子以及分泌的细胞因子来区分。这些蛋白通过信号通路来进行调控。例如，IL-6与受体结合导致Stat3磷酸化，从而引起IL-17A的表达。T细胞的可塑性，即细胞对周围环境产生应答从而转变自身表型的能力，特别引起研究者们的兴趣，尤其是Th17和Treg细胞。这本手册讨论和证实了下列平台如何用于T细胞分化的研究：细胞表面标志物用于鉴定异质性样本中的细胞群；胞内细胞因子染色(ICS)检测单个细胞内的细胞因子；BDPhosflow™技术检测关键蛋白的磷酸化；BD™CBA技术检测样本中分泌的细胞因子水平BD生物科学不断更新分析和富集T细胞的产品。BD生物科学的所有试剂都有全球性的客户服务和技术支持，来帮助客户充分利用BD的产品来促进他们的研究。综合性的服务包括由经验丰富的科学家和技术专家提供技术应用支持以及客户分析服务。T细胞研究的可靠保证：研究CD4T细胞分化和可塑性的灵活工具ForResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticortherapeuticprocedures.4T细胞综述T细胞亚型概要根据功能，T细胞可以分为三群：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞(Th)和调节T细胞(Tregs)。不同细胞表达的表面标记物和分泌的细胞因子的差异，为研究T细胞多样化的性质和功能提供了有价值的线索。1例如，CD8+细胞毒性T细胞通过释放穿孔蛋白、颗粒酶、颗粒溶解素从而消灭被感染的靶细胞，而CD4+辅助T细胞(如Th1、Th2、Th9、Th17和Tfh细胞)几乎没有细胞毒性，它们通过分泌细胞因子作用于其他白细胞(如B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)，从而清除病原体。Tregs通过多种机制抑制T细胞的功能，包括与效应T细胞亚群结合从而阻止其分泌细胞因子。为了支持多色流式细胞术在T细胞研究中的应用，BD提供了一系列试剂(下表中红色标记部分)。BD现在可以提供更多的选择，很多试剂都有多种标记，包括用于紫色激光的BDHorizon™V450和V500。Tregs：免疫反应的重要调控者Tregs在维持体内免疫平衡中起了重要作用，而且与许多自身免疫疾病也有关系4。流式细胞术是Tregs分选和分析的有力工具。“天然”Tregs(nTregs)(天然表达CD25、FoxP3)和适应性或诱导性Tregs(iTregs)(诱导活化后表达CD25、FoxP3)5。CD25在人类和小鼠Tregs中的表达不同。所有的小鼠CD25+细胞都被认为是Tregs，而人类细胞中，只有高表达CD25的才被认为是Tregs。6此表汇总了主要已知的T细胞标志物标志物可以由于细胞环境、分化状态和其他因素变化而改变。加粗部分为关键细胞因子。BDBiosciencesoffersreagentsformoleculesinred.热门研究领域细胞类型细胞毒性T细胞Th1Th2Th92Th17Tfh3Treg主要功能杀死被病毒感染的细胞活化巨噬细胞增强其杀菌功能，诱导B细胞产生抗体诱导B细胞抗体产生与T细胞增殖相关并增强B细胞IgG和IgE的产生增强中性粒细胞反应调节抗原特异性B细胞的发育和抗体产生免疫调节目标病原体病毒和一些胞内细菌胞内病原体寄生虫寄生虫真菌和胞外细菌副作用移植排斥自身免疫疾病过敏反应，哮喘过敏反应器官特异性自身免疫疾病自身免疫疾病自身免疫疾病，癌症细胞表面MarkersCD8CD4CXCR3CD4CCR4,Crth2(human)CD4CD4,CCR6CD4,CXCR5CD4,CD25诱导其分化的细胞因子IFN-γ,IL-2,IL-12,IL-18,IL-27IL-4,IL-2,IL-33IL-4,TGF-βTGF-β,IL-6,IL-1,IL-21,IL-23IL-12,IL-6TGF-β,IL-12分泌的细胞因子IFN-γ,TNF,LT-αIFN-γ,LT-α,TNFIL-4,IL-5,IL-6,IL-13IL-9,IL-10IL-17A,IL-17F,IL-21,IL-22,IL-26,TNF,CCL20IL-21TGF-β,IL-10转录因子T-bet,Stat1,Stat6GATA3,Stat5,Stat6GATA3,Smads,Stat6RORγt,RORα,Stat3Bcl-6,MAFFoxP3,Smad3,Stat5ForResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticortherapeuticprocedures.DIFFERENTIATION5分选的外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4、CD25、CD127和CD45RA表达情况的四色分析结果。PBMCs用BD™人调节性T细胞分选试剂盒(货号：560753)染色后在BDFACSAria™分选仪上进行分选。淋巴细胞用FSC/SSC和CD4+表达圈门后选出CD4Treg细胞(图A)。分别对CD45RA阴性和阳性细胞用同型对照(货号：557732)和标记的FoxP3单抗(货号：560045)染色。A图：用CD45RA圈门前CD4阳性细胞CD25和CD127的表达情况。B图：分选的CD25highCD127lowTreg中分别对CD45RA+和CD45RA-细胞hFoxP3的表达情况(蓝色直方图)和其同型对照(虚线)。获取和分析均在BD™LSRⅡ上进行。适应性或诱导性Tregs源于胸腺的单阳性CD4细胞。他们经过同源抗原的充分刺激和特定的免疫调控细胞因子，如TGF-β、IL-10、IL-2的作用下分化成表达CD25和FoxP3的Tregs。据报道，iTregs具有适应性，具有转变成其他T细胞亚群，如Th1和Th17细胞的能力。7尽管也有报道说存在小部分细胞是FoxP3-Tregs，但FoxP3是目前鉴定Tregs的主要标志。转录因子Foxp3作为Tregs标志的发现，使得科学家能更好的定义这一细胞群，从而发现更多的Tregs标志物，包括CD127。许多已发表的文献以及BD的数据证实，CD127的表达与FoxP3呈负相关6,8。因此分选CD4+、CD25+、CD127-的细胞可以得到有活性的Tregs。CD25PECD127AlexaFluor®64710210310410506.811020103104105AlexaFluor®647hFoxP3RelativeCellNumber102101100103104020406080100AlexaFluor®647hFoxP3RelativeCellNumber102101100103104020406080100BATregs的富集Miyara9,10和Hoffmann11的研究表明，CD45RA是鉴定、分离天然Tregs亚群的有效标记。CD45RA+Tregs的可塑性可能更小，维持Foxp3表达水平和扩增状态。CD45RA抗体已包括在BD生物科学新分选试剂盒中。在下述试验中，CD45RA+Tregs亚群(左边直方图，蓝色部分)没有FoxP3表达降低的趋势。然而意外的是，CD45RA-Tregs亚群(右边直方图)部分细胞出现FoxP3表达降低的现象，这还有待于进一步的研究。ForResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticortherapeuticprocedures.6由年龄或所接触抗原的不同造成的供体差异性能引起外周淋巴细胞群(包括外周血中发现的)显著的异质性。BD可以提供全面的试剂产品，包含用于分析细胞表型的表面标志产品、检测效应分子(细胞因子和趋化因子)和细胞信号分子(转录因子和磷酸化蛋白)的胞内流式细胞术产品。BD同样也提供优化的缓冲液、荧光抗体组合以及同时进行表面和胞内流式细胞术的试剂盒，使得研究者能从单个样本的分析中获得最多的信息。支持和简化T细胞研究的主要工具T细胞分析的工具和技术工具/技术流式细胞术/表面流式细胞术/胞内BD流式液相多重蛋白定量技术(CBA)ELISPOTELISA体内捕获实验可检测的分子表面表面和胞内分泌的或细胞内的分泌的(原位)分泌的分泌的(体内)多参数是是是否否否单细胞/细胞亚型信息是是否频度，没有亚型信息否否抗原特异性是是是是是是实验后细胞存活是否是，检测的是细胞分泌的分子否是是蛋白定量可能*可能*是否是是仪器流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪ELISPOT读板仪分光光度仪分光光度仪ForResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticortherapeuticprocedures.*用标准品如BDQuantibrite™微球PPPPPPPPPP用ELISA或ELISPOT方法检测分泌的细胞因子用流式细胞仪检测特异细胞胞内细胞因子表达用流式细胞仪分选细胞或检测细胞表面蛋白表达用BrdU，AnnexinV和其他方法检测增殖和凋亡用BDPhosflow抗体检测关键蛋白的磷酸化水平利用优化的缓冲液和抗体借助流式细胞仪检测转录因子表达用BDCBA技术同时检测分泌到胞外的多种细胞因子BD提供的全面研究T细胞的多种工具BD产品利于检测细胞表面标记物、磷酸化蛋白、转录因子、细胞凋亡标志以及细胞因子。分泌的细胞因子可通过ELISA或ELISPOT来检测单个细胞因子，或者通过BDCBA技术可在同一个孔中多重分析多个细胞因子。利用这些技术，研究者能分析某一类型细胞的百分率及其活化状态，也可检测到细胞群中微小的变化(蛋白磷酸化状态、细胞因子水平等)。MULTIPARAMETER7利用特异性表面标记物对细胞进行分型T细胞及其亚群可通过细胞表面标志物的不同来进行鉴定，包括CD3、CD4、CD8和CD25。对其他标志物(如CCR7，CD62L，CD69)的分析为细胞在体内的归巢和定位潜能以及感兴趣的T细胞亚群的活化状态的分析提供了重要信息。细胞表面标记物同样可用于细胞分选仪器，如BDFACSAria™III和BDInflux™系统。纯的活细胞可进行培养扩增、分化和维持。胞内流式细胞术胞内流式细胞术，尤其与细胞表面染色相结合时，是检测同质性或混合细胞群中的细胞因子和转录因子的得力工具。为了检测胞内蛋白，细胞必须经过固定、破膜处理以使荧光抗体进入细胞，从而检测感兴趣的目的蛋白。不同的抗原对固定破膜的敏感性不同，因此固定和破膜需要额外的优化实验流程。为了检测细胞因子(分泌蛋白)，需要蛋白转运抑制剂如BDGolgiStop™(莫能菌素)或BDGolgiPlug™(布雷菲德菌素A)将蛋白阻留在细胞内。BD生物科学提供两种不同的优化产品，BDFastImmune™和BDCytofix/Cytoperm™，用于胞内细胞因子染色。BDFastImmune试剂盒是检测人全血和PBMC样本中细胞因子、细胞表面标志和其他分子的完整的最佳化体系。为了实验设计的灵活性和结果的可靠性，BDCytofix/Cytoperm缓冲液体系和实验步骤使得研究者自由设计流式实验，如下图中对IL-17A和IL-17F的比较。IL-17AandIL-17FstainingusingaBDCytofix/Cytopermprotocol.IL-17A和IL-17F均是IL-17细胞因子家族的成员。虽然二者都被认为与炎症应答有关，但IL-17A和IL-17F在不同的但有重叠