CRISPR-procedure

CRISPR流程设计靶组分并使用CRISPR设计工具1d1.输入目标基因组DNA序列我们提供在线CRISPR设计工具()可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。或者，可以通过确认任何5’-NGG直接上游的20-bp序列手动选择引导序列。2.用在线工具确定，订购需要的oligos和引物。如果手动确定分裂位点，oligos或引物应该按照fig4b.c设计。设计ssODN模板（任选）1h3.设计和订购定做的ssODN。购买直接来自IDT或首选供应商的正义或反义ssODN的其中一个。我们推荐手动设计每侧至少40nt的同源臂，90nt可以得到最佳HDR效率。PAGE纯化ssODN不是必要的。4.重新溶解和稀释ssODNultramers到终浓度10uM。不要使正义和反义ssODNs结合或退火。储存在-20°。准备sgRNA表达结构5.为了构建sgRNA表达结构，使用PCR表达cassette（选项A）或以质粒为基础的步骤（选项B）（A）通过PCR扩增构建sgRNA表达结构2h（i）准备稀释的U6PCR模板。我们推荐使用pSpCas9（BB）或pSpCas9n（BB）（spl.2）作为PCR模板，但任何包含U6的质粒都可以使用。用ddH2O稀释模板到10ng/ul。注意，如果一个质粒或cassette已经包含一个U6驱动的sgRNA作为模板，PCR之后就要进行一个凝胶回收（gelextraction）（step5Aiv），用QIAquick胶回收试剂盒，来确保产物只含有目的sgRNA并且没有从模板来的任何sgRNA。（ii）准备稀释的PCR引物。ddH2O稀释U6-Fwd和U6-Rev（均用CRISPR设计工具或手动设计，对每个sgRNA是特异的。step1）引物（table1）到终浓度为10uM：加10ul100uM引物母液到90ulddH2O。（iii）U6-sgRNAPCR。以下反应for每个U6-Rev引物：关键步骤：为了使扩增sgRNAs中的错误最小化，用高保真的聚合酶是很重要的。其他的高保真聚合酶，例如PfuUltraII（Aligent）或KapaHiFi(KapaBiosystems)，可以被用作替代。（iv）用以下循环条件做PCR（v）反应完成后，把一个样品产物跑胶来证明扩增成功：2%（wt/vol）琼脂糖胶，有SYBRSafedye的TBEbuffer。5ulPCR产物用来跑胶，15V/cm30min。反应成功的话应该有一个单独的370bp产物，模板应该看不见。？troubleshooting（vi）纯化PCR产物，用QIAquickPCR纯化试剂盒。洗提DNA在35ulEBbuffer（试剂盒中的）或H2O。Pausepoint：纯化的PCR产物可以在-20°储存几个月（B）sgRNAcloning进入pSpCas9（BB）质粒，与Cas9共表达3d（i）准备sgRNAoligos插入。重悬每个设计的sgRNA的顶部和底部strands（step1）到终浓度为100uM。准备以下体系使sgRNAoligos磷酸化和退火（顶部和底部组分strands）：（ii）使oligos在thermocycler中磷酸化和退火，用以下参数：37°30min;95°5min;用5°/min降至25°。（iii）1:200稀释磷酸化的和退火的oligos：加1uloligo到199ul室温ddH2O。（iv）sgRNAoligoscloning到pSpCas9(BB)。每个sgRNA进行以下反应。我们推荐用一个未插入的，pSpCas9(BB)-作为一个阴性对照。注意：如果在之后的应用中用Cas9D10A切口酶突变体，用pSpCas9n(BB)代替pSpCas9(BB)。或者，如果需要基于荧光的筛查或选择，用pSpCas9(BB)-2A-GFP,pSpCas9(BB)-2A-Puro,pSpCas9n(BB)-2A-GF或pSpCas9n(BB)-2A-Puro代替。以下步骤使用pSpCas9(BB）为例：（v）孵育ligation反应共1h(iv)用PlasmidSafe核酸外切酶处理ligation反应，消化残留的线性DNA。这个步骤可选择但高度推荐。（vii）孵育PlasmidSafe反应：37°30min,70°30minPausepoint：此处理后，反应可以储存在-20°至少1周（viii）转化。转化PlasmidSafe处理的质粒到感受态E.coli菌株，根据细胞提供的说明。我们推荐Stbl3菌株做快速转化。加2ul产物（step5Bvii）到20ul冰上预冷化学处理的感受态Stbl3细胞，冰上孵育混合物10min，42°热激30s，立即放回冰上2min。加100ulSOC培养基，涂到含有100ug/mlampi的LB平板。37°孵育过夜。注意，当转化氨苄抗性质粒时，不必要在热激后为了生长期而孵育感受态细胞。（ix）Day2：观察平板克隆生长情况。通常，阴性对照没有克隆（ligationofBbsI-digestedpSpCas9(BB)alonewithoutannealedsgRNAoligoinsert），在pSpCas9(sgRNA)(sgRNAinsertedintopSpCas9(BB))平板上有几十-几百个克隆。？troubleshooting（x）在每个平板上挑出2-3个克隆来检查sgRNA是否正确插入。用无菌枪头将单克隆挑至3ml含100ug/mlampi的LB培养基。37°摇床孵育过夜。（xi）Day3：从培养基中分离质粒DNA：QIAprepspinminiprepkit（xii）确定CRISPR质粒序列。通过用U6-Fwd引物测序U6启动子确认每个克隆的序列。可选：用Cbh-Fwd和SXRP002-007引物（spl.data1）测序Cas9基因。参考pSpCas9(BB)cloningvector序列的测序结果来核对20nt引导序列被插入在U6启动子和remainderofthesgRNAscaffold之间（fig4c）。细节和pSpCas9(BB)在GenBank的序列图谱可以在找到。？troubleshootingsgRNA功能确认：HEK293FT细胞培养和转染3-4d关键：CRISPR-Cas系统已经在许多哺乳动物细胞系中应用。每个细胞系条件可能不同。下面我们详述了HEK293FT细胞的转染条件。注意，ssODN介导的HDR转染，用AmaxaSF细胞系Nucleofectorkit，在step14-29说明。hESC(HUES9)培养和转染，step30-53。6.HEK293FT细胞培养。根据厂商推荐。D10培养基，补充10%（vol/vol）FBS，37°，5%CO2。7.接着，弃掉培养基，从容器一端轻轻加入DPBS漂洗一次，不要使细胞移动。加2mlTrypLE到T75flask，37°5min孵育体系。加10ml热的D10培养基终止胰酶反应，转移细胞到50mlFalcon管。轻轻上下吹打使细胞分离，再将细胞种在新的培养瓶。关键步骤：我们通常2-3d分细胞，分流比1:4或1:8，不要让细胞多于70%。Cellsarediscardeduponreachingpassagenumber15（传到15代时丢掉细胞？）8.准备转染细胞。转染前，将细胞很好的分离到24孔板，用无抗生素D10培养基培养16-24h。细胞密度在1.3×105每孔，总体积500ul。根据细胞提供者的指南按比例增加或减少。关键步骤：不要用多于推荐密度的细胞，可能会减少转染效率。9.转染当天，细胞最好在70-90%。可以用lipo2000或AmaxaSFcellline4D-NucleofectorXkit（根据manufacturers’instructions）。按以下方法转染：sgRNAsclonedintopSpCas9(BB),转染500ngsequence-verifiedCRISPRplasmid(pSpCas9(sgRNA))。如果转染超过一种质粒（Box2）,按照equimolar比例混合，并使用不超过500ng总DNA。PCR扩增的sgRNA，混合下列：关键步骤：我们推荐转染三个平行以得到可靠的数据，包括转染对照（如GFP质粒）来保证转染效率。如果做荧光挑选或药物筛选，pSpCas9(sgRNA)-2A-GFP或pSpCas9(sgRNA)-2A-Puro可以用来代替pSpCas9。此外，pSpCas9(BB)cloningplasmidand/orthesgRNAamplicon单独转染作为阴性对照，为了下面的功能实验。10.轻轻加lipofectaminecomplex到细胞中，因为HEK293FT很容易脱落，可能会导致转染效率低。11.24h后观察细胞转染效率。转染对照（如GFP）中的荧光细胞百分数可以用荧光显微镜看到。通常会有多于70%的细胞转染了。？troubleshooting12.补充额外的50ul热的D10培养基到培养基中。关键步骤：从孔的一边非常缓慢的加D10，不要用冷的培养基，可能会使细胞脱落。对HEK293FT细胞，嘌呤霉素选择的浓度可以在1-3ug/ml（可能根据细胞系而有所不同）。13.转染后孵育细胞48-72h，之后传代并做downstreamapplicationsorharvestingforindelanalysis。共转染CRISPR质粒和HDR模板到HEK293FT细胞（可选）3-4d14.使1-2ug靶vector线性化:在一个同源臂旁边或任何一个同源臂的远端vectorbackbone的限制性位点切割。或者，如果使用ssODNs，只要重新溶解他们到终浓度为10uM（step4）并且跳过step15,1615.在0.8-1%（wt/vol）琼脂糖胶上跑小量的线性质粒和未切割质粒，确定线性化成功。线性化的质粒应该跑在超螺旋质粒上面（runabove）16.纯化线性质粒：QIAQuickPCRPurificationkit,elutein35μlofEBbuffer17.准备转染的细胞。在T75或T225flasks中培养HEK293FT。在转染时要有足够的细胞（2×105细胞每个转染，如果用AmaxaSFcellline4D-NucleofectorXkitS）18.预热平板做转染。加1ml热的D10培养基到12孔板的每个孔，将平板放在培养箱中保持培养基热的。19.用下面表格中选项A来准备共转染HDR靶质粒和Cas9质粒或选项B来共转染ssODN与Cas9质粒。转染对照，step9。如果一个sgRNA被clonedintopSpCas9(BB)-2A-GFP，细胞也可以被荧光挑选出来。如果用Cas9切口酶介导HDR，pSpCas9(sgRNA)用pSpCas9n(sgRNA)代替Step5B(v)。关键步骤：HDR的应用，我们推荐cloningsgRNAguidesintooneofthesgRNAexpressionplasmids（step5B），而不是用以PCR为基础的表达方法。20.分离细胞做转染。弃掉培养基，用DPBS轻轻地漂洗细胞一次，注意不要洗脱细胞。加2mlTrypLE到T75flask，37°孵育5min，加入10ml热的D10培养基，在50mlfalcon管中磨碎。关键步骤：确保轻轻的磨碎细胞，分离出单个细胞。大块细胞会降低转染效率。21.细胞悬浮液中分装10ul，稀释到90ulD10培养基中培养。计数细胞，计算需要转染的悬液体积。我们通常转染2×105细胞每个condition，用AmaxaSFcellline4D-NucleofectorXkitS,并且我们推荐多算20%的细胞来平衡后面的损失