流式细胞仪现状与临床应用进展

流式细胞仪现状与临床应用进展Flowcytometryandclinicalapplicationofthestatusquo周彬流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其他生物微粒，以及人工合成微球逐个进行多种物理或生物学特征快速定量分析和分选的技术[1]。流式细胞仪是测量细胞的散射光和标记荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量，并分类收集的高精密仪器。流式细胞仪可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。如今，流式细胞仪（图1，最常用的流式细胞仪，配备双色激光器）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特点，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，如细胞生物学、细胞遗传学、生物化学、免疫学、肿瘤学、血液学等。图1：BD公司临床型流式细胞仪FACSCalibur一、流式细胞仪工作原理将待测细胞制成经荧光染色的单细胞悬液，在一定压力驱动和鞘液包绕作用下，细胞排成单列高速通过流动室，形成细胞液柱。当液柱中的细胞通过检测区时，在激光光源照射下，产生散射光和荧光信号。光散射信号分为前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC），它们分别反映细胞的大小和颗粒度，根据这些特性可以初步将细胞分类。经过一种或几种荧光标记的样本，在激光束的激发下，可以产生特定波段的荧光，荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片，几种不同波长的荧光信号被分离开来，由相应荧光检测器接收，这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或细胞内物质的浓度。接收的光信号最终转换为可被计算机识别的数字信号，输送到计算机中进行分析，进而得到相应细胞的各种特性分布和计数结果（图2）光学系统激光光源光收集系统液流系统流动室液流驱动系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统图2：流式细胞仪的工作原理一些流式细胞仪还可以通过物理加电或机械的方法将感兴趣的细胞分选出来。分选标准由细胞分析参数而定，还可以根据特定参数的强度来定。通常，流式细胞仪分选细胞是通过分离收集含有目的细胞的液滴来实现的。流动室的喷嘴在超高频的压电晶体作用下产生高频振动，使喷出的液流断裂为均匀液滴，含有待分选细胞的液滴将被充以正负不同的电荷，经过带电偏转板时，在高压电场的作用下，带电液滴偏转，落入相应的细胞收集管中，不予充电的液滴则落入中间的废液吸引器，这样就可以得到所需要的分离纯化的细胞了。二、临床流式细胞仪的技术进展近年来，流式细胞仪技术迅速发展，应用日趋广泛，其主要技术趋势有：1．多激光，多色分析：在临床上，流式细胞仪的发展经由了最早的双色荧光分析，到三色荧光分析，到现在的四色荧光分析流式细胞仪。目前临床上广泛使用的是单激光三色或双激光四色分析流式细胞仪。近年，为了使样本一次检测更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪，如BD公司的FACSCanto（图3），这一新型流式细胞仪安装固定校准的双激光，可同时作六荧光分析。为了增加检测参数而不影响检测灵敏度，仪器采用了新型光路信号收集检测技术，利用光反射大于光透射的原理，被接收的荧光信号经过一系列双色性反射镜，几种不同波长的荧光信号经过几次反射，被分离开来，光路信号收集系统收集检测反射光信号，而被检测的信号透过反射镜，由相应荧光检测器接收。这样，在增加荧光检测器的同时，大大提高了信号检测灵敏度。图3：FACSCanto六色流式细胞仪2．新荧光染料的开发：由于多色分析的需要，人们发现了更多的不同激光激发的不同波长的荧光染料。如紫外光激发的PacificBlue，AlexaFluora405；蓝光激发的AlexaFluora488；红光激发的AlexaFluora647等。另外，为了使用一个激光器，同时检测更长波长的荧光信号，还使用荧光耦连物，如PE-Cy5，Cy5为吲哚双羰花青衍生物，最大吸收峰为640nm，单独使用时可被红光激发，在安装488nm激光的流式细胞以上，PE被激发光激发，其发射的红光能量被传递给Cy5，仪器上检测到的信号是Cy5发射的红光。这类荧光染料还有PE-Cy7，APC-Cy7，PerCP-Cy5.5等。3．电子系统数字化：近两年，流式细胞仪开始由模拟信号系统向数字化信号系统转变，如BD公司的FACSAria、FACSCanto、LSRII等都是数字化系统。在检测中，数字化电子系统连续取样，将信号以数字形式直接保存在存储器内，再将数字转换为相应参数值。这样一来，就使得检测速度更快，信号采集速度可达每个脉冲10,000,000次/秒。有了数字化电子系统，就可以测定任意信号的脉冲高度、宽度和面积，荧光间补偿的调整也更加简单，可以自由进行激光内和激光间的荧光补偿，并可以脱机补偿。三、流式细胞分析的主要临床应用在临床应用中，主要检测标本为血液，以及部分积液或灌洗液中的细胞，当然，还可以将组织标本通过机械、化学等方法处理为单细胞，再进行流式细胞分析。临床上，主要通过检测细胞免疫分子的表达，进行疾病诊断，监控，疗效判断等。为了充分了解细胞上的分子表达，细胞免疫分析多采用流式细胞仪进行多参数分析。主要应用有[2]：淋巴细胞亚群分析在临床上广泛应用。外周血淋巴细胞亚群分析主要用于HIV感染和移植后治疗监测；胎儿血样的淋巴细胞亚群分析，可以诊断原发性免疫缺陷症；脑脊髓液标本进行淋巴细胞亚群分析，用于中枢系统炎症的诊断；支气管及肺泡灌洗液标本进行淋巴细胞亚群分析，用于肺部炎症和／或自身免疫性疾病。HIV感染患者血样，除了进行CD4+T淋巴细胞绝对计数分析外，还可以通过CD8+T淋巴细胞CD38+表达分析和纯真T淋巴细胞与记忆T淋巴细胞分析，监测疾病进程；Th1/Th2分析，有助于判断病人免疫功能状态；抗病毒治疗后，可以通过监测病毒特异的T淋巴细胞，观察疗效。败血症患者可进行单核细胞HLA-DR表达强度的分析，判断疾病严重程度。外周血HLA-B27分析用于强直性脊柱炎的辅助诊断；HLA-DR4分析用于诊断风湿性关节炎。急性白血病和髓系异常增生性疾病及非霍奇金淋巴瘤的初步诊断与监测需要作外周血和/或骨髓样本的恶性细胞免疫分型。目前临床上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45-SSC设门，特异分析恶性细胞的表型。针对干细胞移植，还需要用流式细胞仪进行CD34+造血干细胞绝对计数。贫血患者可以进行网织红细胞计数，协助诊断贫血；CD55和CD59分析有助于诊断睡眠性阵发性血红蛋白尿。血小板分析主要有：活化血小板分析辅助诊断血栓性疾病；网织血小板分析辅助诊断血小板减少性疾病。临床上，流式细胞仪还用来分析细胞的功能特征。如中性粒细胞CD11a/b分析用于诊断中性粒细胞黏附缺陷性疾病；细菌吞噬作用检测用于诊断先天性或暂时性细胞吞菌作用缺陷；过敏源特异的嗜碱性粒细胞脱颗粒反应检测诊断不明过敏源的过敏性疾病；髓过氧化物酶分析诊断髓过氧化物酶缺陷症。实体组织及活检标本可以进行DNA分析，对实体瘤的细胞倍体及增生状态进行辅助诊断。四、流式细胞仪临床应用的新进展1．多色分析：在临床上，为了准确设门，除了检测标记外，还需要进行细胞群体特异的标记，如白血病细胞分析需要添加CD45标记设门，区别白血病细胞与正常细胞[3]；T淋巴细胞分析可以采用CD3标记设门，特异分析T淋巴细胞（图4）。因此，临床分析一般采用多参数分析。利用多参数分析技术，还可以同时分析细胞群体标记与细胞功能标记，进而充分了解不同群体不同功能的细胞。另外，利用多参数分析功能，可以将细胞表面标记和细胞胞浆内标记（如细胞因子，细胞内酶，DNA等）结合起来，同时检测，大大提高了流式细胞分析的信息量。2．绝对计数：传统的流式细胞分析方法提供了关于细胞表达抗原频率的信息，通过多个细胞表面抗原的多参数分析，可以将细胞分为各种亚群。阳性群体是指抗体荧光表达高于阴性对照的一群细胞，通过这种方法，可以很容易地计算不同细胞群体的数量，通常报告门内的阳性或阴性细胞的百分比（图5上图）。临床上做淋巴细胞亚群计数时，除了得到细胞亚群百分比，还需要得到细胞亚群的绝对数量。做细胞群体的绝对计数的一种方法是：利用血球计数仪检测淋巴细胞数量，再根据流式细胞仪得到的细胞群体百分比，计算得到每微升的淋巴细胞数量，这种方法叫做双平台方法。但是，双平台的方法需要两种仪器，且仪器有系统误差，计算的结果的重复性和准确性影响因素较多。近年来，为了保证分析结果，临床上广泛使用单平台绝对计数方法。与传统的双平台方法不同，单平台方法是通过在流式细胞仪上使用已知数量的参考微球，可以直接报告绝对计数。即通过获取的目标细胞与参考微球的比例、参考微球数量和样本体积，得到每微升的淋巴细胞数量（图5中图）。这种单平台方法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证[4]。单平台细胞绝对计数在临床中的主要应用有：CD4+T淋巴细胞亚群绝对计数[5]（图4），CD34+造血干细胞绝对计数[6]，等。图4：T淋巴细胞亚群绝对计数分析：使用绝对计数管做外周血CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC四色分析（粉色群体为绝对计数用的已知含量标准微球）图5：使用流式细胞仪进行细胞定性分析，细胞绝对计数分析和荧光定量分析上图：传统分析——细胞阳性百分含量；中图：细胞绝对计数——分析每微升细胞含量；下图：荧光定量分析——分析细胞平均抗体结合量3．荧光定量分析：与传统的荧光定性分析不同，荧光定量分析（QFC）可以判断细胞上抗原表达密度，细胞荧光强度越强，细胞抗原表达密度也越高。使用已知荧光分子数的标准微球，可以检测出待测样本中目标群体的细胞平均结合抗体数（AntibodyBindingCapacity,ABC）[7]，[8]（图5下图）。如BD公司的QuantiBRITE系统，就是检测细胞上平均PE荧光分子数，进行标准化荧光定量分析的系统。其检测方法是：在流式细胞仪上检测一系列已知PE分子数的荧光标记标准微球上的荧光强度，确定标准微球上的PE分子数与流式细胞仪检测荧光强度（FL2）之间的标准曲线，再检测待测样本，由测定的细胞平均荧光强度，根据PE荧光分子数-FL2平均荧光强度双对数标准曲线，得到待测样本的细胞平均结合荧光分子数。临床上需要做荧光定量分析，因为在细胞的发育分化过程或疾病进程中，细胞某一抗原可能持续表达，但其表达密度随细胞变化而改变，这时就需要进行细胞的荧光定量分析了。另外，荧光定量分析可以有效区分弱表达与强表达。再者，由于仪器不同，实验室不同，一些流式细胞分析结果（尤其是弱阳性结果）会有所不同，而荧光定量分析可以消除不同仪器检测检测误差，使不同仪器间的结果具有较好的可比性。现在，这一技术日趋成熟，在临床中的主要应用有：CD8+T淋巴细胞CD38表达的荧光定量分析，监测HIV感染患者发病时的疾病进程；单核细胞HLA-DR表达的荧光定量分析，监测重症感染及败血症的发生；基于蛋白组学的急性白血病的蛋白表达分析[9]等等。4．微生物分析：传统的细菌检查需要培养鉴定，费时费力。同样地，传统的病毒分析也需要培养，分离细胞，再进行免疫学方面的鉴定。将来的临床微生物分析需要迅速，标准化的分析方法[10]。我们已经知道，流式细胞术可以分析病人机体针对感染而发生的免疫反应；另外，利用流式细胞仪还可以直接对微生物颗粒进行分析，快速灵敏，以实现自动化分析的目的；同时，流式细胞术还可以提供微生物细胞的特征性信息，尤其适合生长缓慢的微生物，如分支杆菌，一些霉菌等[11]。近年来，分子标记和核酸染料的不断开发也为流式微生物分析方面的新应用提供了可靠方法。流式细胞术细菌分析的主要临床应用有：利用核酸标记和荧光标记抗体，灵敏、特异地直接检测标本中存在的细菌；分析抗生素对致病菌的影响，帮助选择治疗方案。流式细胞术真菌分析的主要临床应用有