高速逆流色谱技术 综述

高速逆流色谱技术1.概述高速逆流色谱（high-speedcountercurrentchromatography，简称HSCCC），是20世纪70年代由美国国立卫生院（NationalInstituteofHealth，简称NIH）Ito博士首创，并且在最近10年之内发展迅速，是一种可在短时间内实现高效分离和制备的新型液-液分配色谱技术，这项技术可以达到几千个理论塔板数的。它具有操作简单易行、应用范围很广、无需固体载体、产品纯度高、适用于制备型分离等特点。自1982年第一台仪器问世，就开始了HSCCC的现代化进程。HSCCC用于天然药物化学成分的分离始于1985年，到1989年达到一个高潮。自2000年9月起国际逆流研究领域每隔2年举行一次世界逆流色谱学术会议。近几年,人们对健康的认识越来越深刻,更多的人追求天然绿色的健康理念,故HSCCC作为一种对提取物污染小的制备技术,它的应用越来越受到了人们的关注。鉴于HSCCC的显著特点,此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。目前,HSCCC已从制备型发展到了分析型,甚至是微量分析型,应用范围也十分广泛[2]。高速逆流色谱技术在我国的应用较早,技术水平在国际领域也处于领先地位。目前,我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。我国的深圳同田生化技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业。公司拥有自主知识产权的高速逆流色谱专利技术,现已研制并生产出TBE系列分析型,半制备型TBE300，300A,制备型TBE�1000高速逆流色谱仪设备。2.基本原理高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其分离原理是进行分离纯化时，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相,并将其充满螺旋管柱,然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转,同时以一定的流速将流动相泵入柱内。在体系达到流体动力学平衡后(即开始有流动相流出时),将待分离的样品注入体系,其中组分将依据其在两相中分配系数的不同实现分离。HSCCC分离效率高，产品纯度高；不存在载体对样品的吸附和污染；制备量大和溶剂消耗少；操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。高速逆流色谱仪器的装置如图1所示，它的公转轴水平设置，螺旋管柱距公转轴R处安装，两轴线平行。通过齿轮传动，使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时，绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。图1高速逆流色谱仪器的装置示意图(引自：齐元英孟兆玲柳仁民等《高速逆流色谱技术及其在天然产物研究中的应用进展》）在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个绝然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，呈现两相的激烈混合(混合区)；其余区域两溶剂相分成两层(静置区)，较重的溶剂相在外部，较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。如图2所示：图2高速逆流色谱螺旋管溶剂体系的区域分布图（引自李爱峰；刘宁宁；柳仁民等《高速逆流色谱原理及其在天然产物化学成分分离中的应用研究进展》理化检验-化学分册44(05)，95-98，（2008））图3为旋转一周混合区域的变化示意图，每一混合区域以与柱旋转速度相同的速度向柱端移动。当流动相恒速通过固定相时，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800r/min旋转时，频率超过13次/s，所以高速逆流色谱有相当高的分配效率。（引自李爱峰；刘宁宁；柳仁民等《高速逆流色谱原理及其在天然产物化学成分分离中的应用研究进展》理化检验-化学分册44(05)，95-98，（2008））3.仪器装置经过多年的开发应用，高速逆流色谱技术在天然产物以及生物活性样品的分离分析等领域取得了长足的进步，仪器设备硬件技术也得到了显著的发展。在逆流色谱技术发展的早期阶段，人们主要侧重于制备型仪器，近年来又对分析型HSCCC的应用报道逐渐增多。由于分析型HSCCC仪器具有体积小、分离速度快、溶剂消耗小等优点，因此在溶剂体系的快速优化、样品的小量制备以及分配系数的测定等方面得到了应用。下表比较分析了分析型仪器与制备型仪器及其操作系数：项目分析型制备型仪器类型J形多层螺旋管离心分析仪J形多层螺旋管离心分析仪螺旋管内径/mm11,到3-4柱体积/ml1.5-5050，最大到1000流速/(ml/min)0.1-12.0-10转速/(r/min)1500-40001200样品量1μg-10mg10mg-10g高速逆流色谱技术的基本系统结构如图4所示，主要由输液泵、进样阀、螺旋管式离心分离管、检测器等组成。由于其操作压力并不高，用普通的中低压泵即可。进样可用带有样品环管的六通进样阀进样。样品的分离是在多层螺旋管式离心分离管内完成。检测器与液相色谱的检测器相同，如紫外检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。图4HSCCC的基本系统结构(引自邓建朝；肖小华；李攻科等高速逆流色谱仪器装置的研究进展，[J]化学通报（印刷版）（2009）)图5为高速逆流色谱原型的横截面示意图，由一个电机带动一对齿形皮带轮，并由齿形皮带带动转动框架，转动框架将管柱支持件和配重组件对称地装在离心仪中心轴两边，在每一个支持件的轴线上都装有一个行星齿轮，与中心管上固定齿轮相啮合，这几个齿轮的尺寸和形状完全一样。为了保证仪器的机械稳定性，用一根短偶联管同轴地装设在转动框架的自由端，偶联管地另一头通过球轴承靠仪器的固定侧壁件支撑，从绕制在支持件上的螺旋管引起的一对流通管，先穿过支持件转轴地中心孔，再穿过偶联管的侧孔到达中心固定管地开口，然后穿过此固定管，从仪器地另一端引出。流通管外采用油脂润滑核塑料套管保护措施，以避免与金属件直接摩擦。图5高速逆流色谱技术地横截面示意图(引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，《样品前处理仪器与装置》，[M]289,(2009))图6为改进后的高速逆流色谱仪，这种仪器装有3个柱支持件，每个支持件上有两个齿轮，一个与装在中心离心轴上地行星齿轮相啮合，另一个与装在管支持件轴线上地齿轮相啮合，为避免流通管地打绞，管支持件轴相对于柱支持件做反向转动。图6改进后的高速逆流色谱仪(引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，[M]290,(2009))目前，国内外商品化的高速逆流色谱技术仪多为在单柱分离系统的改进型，主要可以分为以下几类：1、GS系列由北京新技术应用研究所张天佑教授领导的科研小组研制开发，是国内最早的色谱仪器。主要包括GS10A半制备型HSCCC仪（柱体积为210—250ml，最高转速为1000r/min，单分离柱加配重件结构）以及GS20分析型HSCCC仪（柱体积35ml，最高转速2000r/min），如图7所示图7GS系列HSCCC仪(引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，[M]301,(2009))2、TBE系列由深圳同田生物技术有限公司负责开发。包括TBE-300、TBE-300A以及TBE-1000三种类型，如图8所示.采用三串联柱分离系统，其中TBE-300以及TBE-300A的柱体积设计为300ml，PTFE管径为1.6mm转速为700-1000r/min，TBE-1000型柱体积为1000ml，PTFE管径为2.6mm，转速为400-600r/min。图8TBE系列HSCCC仪(引自网页)3、Quattro系列由英国Brunel大学生物工程研究所lanSurherland教授领导的研究小组研究开发。该系列仪器设计了可以试想自我平衡的爽分离系统，且两分离柱留有多个聚四氟乙烯管抽头，用户可以根据自己的需要，串联或并联出不同的柱体积（150ml-3L），同时还可以进行两个不同的分离过程（如图9所示）图9Quattro系列HSCCC仪((引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，[M]301,(2009))另外，美国PharmaTechRearch公司生产逆流色谱技术仪器也已经有十几年的历史，如CCC-3000以及CCC-1000型仪器（如图10所示）均带有三分离柱串联的自平衡系统，柱体积分别为50ml和120-850ml。CCC-1000也可以根据需要配置不同的分离柱。美国ConwayCentrichrom公司生产的DU-1000型，同样带有三分离柱，其三柱体积并不相同，分别为480ml、85ml、245ml，PTFE管内径为1.6mm。图10PharmaTechRearch系列HSCCC仪((引自李攻科、胡玉玲、阮贵华等，样品前处理仪器与装置，[M]301,(2009))4.应用HSCCC技术已经成为一种备受关注的新型分离纯化技术。由于其具有较好的分辨性、固定相不需要载体、进样量大、分离完全等优点，因此被广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等诸多领域。我国还是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，也是世界上高速逆流色谱仪生产国之一，我国丰富的资源给HSCCC技术提供了广阔的平台。1高速逆流色谱技术在天然产物领域中的应用1.1黄酮类化合物黄酮类化学物质在自然界中广泛存在于多种植物，且对于治疗多种疾病有着重要的作用，是一类比较重要的植物化学成分。现已成功应用HSCCC技术分离提纯该类化合物的对照品。常用的分离黄酮类化合物的溶剂系统为氯仿-甲醇-水（4:3:2），例如潘霞等以芦荟全叶为原料，经过一系列的预处理手段获得芦荟色酮粗提物，采用氯仿-甲醇-水(4:3:2)混合溶液和二氯甲烷-甲醇-水(5:4:2)混合溶液为溶剂分离系统，经过两步HSCCC分离纯化出纯度在95%以上的芦荟色酮单体。通过紫外检测、快原子轰击质谱及核磁共振等方法的结构分析鉴定证实分离所得物质为肉桂酰基-C-葡萄糖苷芦荟色酮。YangFQ等用该体系成功分离了沙棘中的茨非醇。马晓丰等采用HSCCC法，以正己烷-氯仿-甲醇-水(1.5:3:3:2)组成的二相系统对黄芪的醋酸乙酯粗提物进行了分离纯化，分离出的毛蕊异黄酮纯度可达95%以上，并可以初步纯化芒柄花素；然后用正己烷-氯仿-甲醇-水(4:4:5:4)组成的系统进一步纯化芒柄花素，其纯度达95％以上。DuQZ以正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇-醋酸-水(1:2:1:1:5:1)为溶剂分离了大豆中的黄豆苷、染料木苷，以正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(1:3:2:4)为溶剂分离了Ampelopsisgrossedentata中的（+）二氢杨梅黄酮。1.2生物碱大多数的生物碱都具有较活泼的生物活性，故生物碱的HSCCC提取文献报道较多。较常用的溶剂系统主要是氯仿-甲醇-酸性改性剂体系。蒋凯等采用HSCCC分离纯化黄花乌头块根中的生物碱类化学成分，其溶剂系统采用氯仿-甲醇-0.2mol·L-1盐酸（10:3:3），从黄花乌头块根中一次性分离得到8个化合物，其中化合物13β-diacetyl-14-hydroxyhetisine为新化合物，命名为关附未素（GuanfubaseR）。洪波等采用HSC-CC对附子中的化学成分进行研究，分离得到了15-α-羟基新乌碱单体，溶剂系统为氯仿-甲醇-0.3mol·L-1盐酸（4:3:2）。颜继忠等以氯仿-甲醇-0.2mol·L-1盐酸(2:1:1)为溶剂体系，用HSCCC成功分离出金果榄中的巴马亭成分，经测定组分纯度大于99.6%，并由IR、1H-NMR和MS确定结构。FuquanY等利用HSCCC以氯仿-甲醇-0.3mol·L-1盐酸（4:1.5:2）为溶剂系统，从乌头的总生物碱粗提物中分离出高乌碱、N-去乙酰基高乌碱。1.3有机酸有机酸类是分子结构中含有羧基的一类化合物，在中草药的叶、根特别是果实中广泛分布，常见植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸，如酒石酸、草酸、苹果酸、构椽酸、抗坏血酸（即维生素C）等，亦有芳香族有机酸如苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等。王凤美等采用HSCCC，以正己烷-醋酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5)为溶剂系统分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质