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实用指导(一):慢病毒感染MOI预实验MOI:MultiplicityofInfection,译为感染复数,即病毒量与细胞数的比值。每种细胞对慢病毒的敏感性不同,有的容易感染,有的则比较难,同时每种慢病毒载体荧光强度也有差异,所以在正式实验前需要做病毒感染预实验来确认MOI值以达到理想的实验效果。理论上MOI值越高,慢病毒感染上的可能性越大,感染效率越高,但是这样对细胞的毒性也就越大。所以预实验确认MOI值是要在细胞成活率和感染效率中找到一个平衡点。一般如果MOI超过100,甚至200还感染不上,说明慢病毒非常难感染这株细胞,甚至感染不上,那么就要考虑换一种方式,比如腺病毒或者电转(此种情况下比较不推荐再试脂质体,一般也很难转进去)。慢病毒感染MOI预实验步骤:第一天:铺板。设置MOI梯度:可以按照不加病毒,10,20,30,50,80,100来设置MOI梯度,或者根据实际情况设置梯度都可。不加病毒组是用来判定细胞状态的。注:最好设置一组复孔。如下图:细胞接种:一般用24孔板接种2×104个细胞左右。如果细胞特别大可以适当减少,特别小可以增加。原则上以第二天汇合度达到30%-40%为宜。放入培养箱培养第二天:加病毒。按照设置好的MOI算好每孔需要加的病毒量。每孔加病毒量(μl)=MOI×细胞数/滴度(TU/ml)×1000。注:一般第二天细胞数按照倍增来算。例如:病毒滴度1×108TU/ml,接种细胞数2×104,MOI=10。那么,病毒量=10×4×104/1×108×1000=4μl加慢病毒。按照算好的病毒量吸取病毒原液加入培养基中,摇动孔板混匀。注:如果病毒滴度太高,每孔加的病毒太少,移液器量程不够可以先将病毒稀释后再加。稀释倍数根据实际情况来定,稀释液用无血清培养基、Opti-MEM、PBS都可以。加Polybrene:加完病毒的孔中再加入Polybrene,终浓度5µg/ml,摇动孔板混匀。注:Polybrene对部分细胞毒性很大(比如原代神经元,树突细胞等),不要加。如果实在不知道应不应该加,可以增加一组预实验,只加Polybrene不加病毒,跟都不加的组对比。放入培养箱继续培养。第三天:换液提前37℃预热培养基。弃去含病毒的旧培养基,加入预热好的新鲜完全培养基。放入培养箱继续培养。第五天:观察,拍照,确定合适的MOI值在荧光显微镜下观察,并拍照。确定合适的MOI值。
本文标题:实用指导一:慢病毒感染MOI预实验
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