杆状病毒表达系统

杆状病毒表达系统西北农林科技大学生命科学学院2018年杆状病毒简介杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180Kb之间。模式种是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）.核型多角体病毒有两种形式：一种为芽生病毒(buddedvirus,BV)，另一种则为包涵体病毒(occludedvirus,OV)。buddedvirusoccludedvirus杆状病毒生活周期芽出病毒：可以通过细胞-细胞间感染进行传播。包涵体病毒：释放到环境中后，通过昆虫摄食进行传播。如果仅用于感染昆虫细胞系，包涵体形成相关的基因都不是必需的。杆状病毒基因表达的不同表达时相立即早期延迟早期晚期极晚期：该时相表达的蛋白（polyhedrinandp10）与包涵体形成相关，并且表达量极高。生物工程中可以利用这两个蛋白的启动子表达外源蛋白。杆状病毒表达载体系统1981年L.K.Miller根据AcMNPV分子生物学性质及现代分子生物学技术，从理论上阐述了杆状病毒作为载体表达外源基因的可行性。1983年G.E.Smith等成功地利用AcMNPV作为载体在Sf细胞中表达了人β-干扰素基因，完成了从理论到实践的飞跃。G.E.Smith将AcMNPV的EcoRI-I片段（包含多角体蛋白基因）克隆到pUC8质粒上，然后把人β-干扰素基因克隆到BamHI位点。用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。用重组病毒感染Sf细胞，得到β-干扰素。解决重组效率太低的问题1990年P.A.Kitts把一个Bsu36I位点引入到多角体基因附近。用Bsu36I线性化的AcMNPV后，重组效率提高15-150倍，30%的空斑是阳性克隆。1993年P.A.Kitts把两个Bsu36I位点一起引入，结果使重组效率达到90%，但还是需要空斑筛选（多角体，蓝白斑）。直接通过病毒基因组DNA与转移载体（Transfervector）重组示意图构建Bacmid1993年V.A.Luckow用miniF-Kan替换了多角体polyhedrin基因，构建了能在昆虫细胞和大肠杆菌之间穿梭的杆状病毒重组DNA，命名为Bacmid。该名称取自Baculovirus和plasmid。JVirol.1993Aug;67(8):4566-79.LuckowVA,LeeSC,BarryGF,OlinsPO.Bacmidpolyhedrin位点附近序列细节：目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。获得重组病毒的方式转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：“转座”和“同源重组”目前都在使用中。“转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET的FlashBac系统，以及BacmidLtd.的qBac系统。这两种方式与外源基因的表达量无关。几种获得重组病毒过程的对比杆状病毒表达系统的优化启动子、Kozak序列和UTR的优化改造。虽然p10或polyhedrin启动子已经是强启动子，但通过改变上下游相关序列依旧能极大地提高外源基因的产量：PLoSONE20149(5):e96562敲除影响外源基因表达/非必需的病毒基因。比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/Cath）有助于分泌蛋白的表达：S.A.Kabaetal./JournalofVirologicalMethods122(2004)113–118敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：CellBiolToxicol(2010)26:57–68糖基化改造把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的糖基化更像哺乳动物细胞：抗凋亡Bacmid将靶向昆虫凋亡效应蛋白Caspase的小RNA序列克隆到Bacmid上，使病毒感染的昆虫细胞抗凋亡，从而提高外源基因的产量：Zhangetal.BMCBiotechnology(2018)18:24宿主细胞Spodopterafrugiperda细胞系常用的有Sf9、Sf21细胞系适用于转染后获得重组病毒适用于蛋白表达Trichoplusiani细胞系商业化的HighFive细胞系不适用于转染后获得重组病毒适用于蛋白表达，产量高于Sf细胞总结杆状病毒表达载体系统具有如下优点：1.快速高产2.具备翻译后修饰系统3.生物安全性好4.表达的蛋白能正确折叠5.允许用于人类医学杆状病毒表达载体系统的缺点：1.它是个瞬时表达系统2.产量远低于原核系统3.糖基化修饰还不理想无论如何，相对于其他表达系统，杆状病毒表达载体系统（BEVS）是个比较均衡的表达系统：经过长期优化，杆状病毒表达载体系统的产量已经有了极大的提高：目前外源蛋白的生产成本大幅度下降，使杆状病毒表达载体系统能进入到动物疫苗工业领域。完