Annexin-V---PI双染方法

AnnexinV是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。Propidiumiodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基；用冷PBS洗涤细胞两次；用400ul1XBindingBuffer悬浮细胞，浓度大约为1X10cells/ml；在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。5.加入10ulPI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟；在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。使用流式细胞仪正确分析AnnexinV-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经AnnexinV、PI分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经AnnexinV、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。AnnexinV相关图片(8张)1.上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。2.建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证98%的细胞处于在X、Y轴Log1为边界的左下象限中心区域。3.检测annexinV-FITC单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL2（或FL3）PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL2（或FL3）荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL2的阳性信号，此时要降低FL2（或FL3）PMT的电压。4.检测PI单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL2（或FL3）漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1PMT的电压。注：如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。5.设定十字门的位置，FL1和FL2（或FL3）的划定方法如下：5.1设定FL1标尺位置:处于左下象限内的大群细胞是AnnexinV染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。将垂直的FL1标尺设定在紧靠AnnexinV阴性群体右侧0.1-0.2Log单位的地方。5.2设定FL2（或FL3）标尺位置:可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3Log单位的地方。注：在阴性群体门以外的细胞可被识为AnnexinV或AnnexinV和PI阳性的细胞。荧光显微镜观察：滴一滴用AnnexinV-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。注：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。AnnexinV-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。