BD-FACSCalibur流式细胞仪培训手册

FACS101Handbook-1–BDFACSCalibur流式细胞仪FACS101Handbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。一、BDFACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1.电源开关：在BDFACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。2.光学系统：BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射以BDFACSCalibur基本型为例FSCDiode只收488nm波长散射光SSCPMT只收488nm波长散射光FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545nm）FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606nm）FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围（波长650nm）FACS101Handbook-2–3.仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制：LO：样品流速：12l/minMED：样品流速：35l/minHI:样品流速：60l/min功能控制：RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。）STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME结束，仪器恢复STANDBY状态。4.储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空气滤网Airfilter。请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。FACS101Handbook-3–鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。鞘液过滤器：0.22m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。5.上样品区：上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针SampleInjectionTube，将样本输入流动室，还有就是支撑架TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。FACS101Handbook-4–1.2Macintosh计算机与打印机：准备您的细胞样品1.理想样品浓度调至1-10X105cells/ml？一般实验只需0.5ml的样品。2.细胞样品务必放至BDFALCON352052试管中，否则无法上机。3.上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网BDFALCON试管(Cat.No.352235)或35-55m的尼龙筛网。4.供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下载染色方法直接免疫荧光染色Lysed-No-WashProcedureLysed-And-WashProcedure,SimulTEST&HLA-B27PeripheralBloodMononuclearCellProcedureLeukemiaandLymphomaProcedure1LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay间接免疫荧光染色滴定抗体浓度常用试剂5.如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail：[e-mail]或[e-mail]。FACS101Handbook-5–二、开机、关机标准操作2.1FACSCalibur开机1.开启细胞仪电源。2.开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。3.开启计算机。4.确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow，确实旋紧(鞘液筒容量为4L)。5.将废液倒掉，并在废液筒中加入200ml家用漂白水(废液筒容量为4L)。6.将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。7.排除液流管路与过滤器中的气泡。8.取下样品管，执行PRIME功能两次。9.使用1mlPBS，HIGHRUN两分钟。10.可开始分析样品。2.2FACSCalibur关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1.将样品支持架左移，取2mlFACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真空系统抽取约1ml的液体。2.将样品支持架回正，按HIRUN，然后让FACSClean清洗管路10分钟。3.按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。4.取2mldH2O，重复上述步骤1-3。5.注意最后只留约1mldH2O在试管中。6.按STANDBY五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。）7.倒掉废液，并回填200ml漂白水。8.将减压阀放在「VENT漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。9.退出软件“File”“Quit”(如有对话选项，选择“Don‘tsave”)。确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。10.关闭计算机。“Special”“Shutdown”。FACS101Handbook-6–三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。（1）NegativeControl（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1单染）。（3）CD19-PE（FL2单染）。（4）CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2双染）。3.1Calibur开机1.先开启细胞仪本体再打开计算机。*秘技1：如顺序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“connecttocytometer”。解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。2.向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。3.仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。*秘技2：将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。3.2开启CellQuest软件、编辑实验文件4.在苹果菜单下点击CELLQuest启动软件。桌面会出现一’Untitled’实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。FACS101Handbook-7–5.从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。6.在出现的散点图对话方框中点击PlotSource，选择Acquisition(收取)，确认X和Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024。在颜色方框中点击MulticolorGating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。7.说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC-H1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H1024、FL2-H1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。FACS101Handbook-8–8.从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H1024，Y轴：FL2-H1024。点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9.在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10.从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer，此时会出现AcquisitionControl对话方框。如果无法选择ConnecttoCytometer，参考秘技#1。如果没见到AcquisitionControl对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择ShowAcquisitionControl。仪器设置文件注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrumentsettings），含信号器高压（Detector/Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps--Threshold--Compensation。FACS101Handbook-9–11.检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。12.从Cytometer菜单中选择Threshold，出现Threshold窗口在Threshold窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。13.从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。3.3上样品、设置仪器14.使仪器处于HighRUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认AcquisitionControl窗口中Setup前需打叉或打勾(即不储存数据)，点击Acquire。调节FSC/SSC探测器（电压）15.观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节AmpGain从1.00—9.99使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎