血球计数板的使用

血球计数板的使用①血球计数板的原理和构造②方法与步骤①血球计数板的原理和构造Ⅰ构造血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板。1mm×1mm×0.1mm=0.1mm320mm×20mm×0.25mm=100mm325×16型的计数板计数池中央的大格又被双线划分成25个中格，其中的每个中格又被单线划分成16个小格，中央大方格由25×16=400个小方格组成。在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.10mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400mm2。把中央大方格的中方格再分成小方格的分割线并不只局限于中央大方格内，而是一直延伸到正方形凹槽的边缘，所以在其延长线上的4个大方格中分割线显得密集。25×16型的计数板一般计数四个角和中央的五个中方格（5×16=80个小方格）的细胞数。Ⅱ血球计数板的原理计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品计数三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2N=(N1+N2+N3)/3N3=(n3-1+n3-2)/2N1=(n1-1+n1-2)/2计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算。n1-1n1-2N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算。n2-1n2-2N2=(n2-1+n2-2)/2N3=(n3-1+n3-2)/2计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算。n3-1n3-2N3=(n3-1+n3-2)/2将计数板及盖玻片用流水冲洗，擦干，重复上述步骤，对每个样品可计数三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2N=(N1+N2+N3)/3N3=(n3-1+n3-2)/2将同一样品的计数结果，取平均值。代入下式，求算单胞藻的密度：N小格平均每小格内的细胞数=N/(5×16)设每毫升中有x个单胞藻x个N小格×16×25个1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x个=N/(5×16)×16×25个1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x=N/(5×16)×16×25个×1cm3×1000÷(1mm×1mm×0.1mm)=50000N②用血球计数板对藻细胞进行计数的方法与步骤：ⅰ检查计数室先用显微镜对计数板的计数室进行镜检是否干净。若有污物，则需用清水清洗，吹干，用擦镜纸擦拭干净。盖玻片使用前浸在75%的酒精溶液中，使用时用眼科镊取出，放在滤纸上吸水，用擦镜纸擦拭干净。将盖有盖玻片的计数板放在显微镜的载物台上，调焦，用低倍镜找到计数区检查是否干净。从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使单胞藻分布均匀，防止单胞藻凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得的培养液中的单胞藻数量误差小。注意，当藻液浓度高时，为了便于计数，可将藻液用消毒海水稀释后进行计数。在计数有鞭毛或有运动性的藻类时，可先吸取定量的藻液，滴加鲁哥氏碘液（1000毫升藻类用15毫升的鲁哥氏液固定）进行固定，然后添加消毒海水稀释后计数。将计数板连同盖玻片一起取下，用细口胶头滴管吸取稀释后的摇匀的单胞藻悬液，迅速将吸管尖靠在计数池上盖玻片的边缘，略挤胶头滴管让培养液利用液体的表面张力，自行渗入。样品流入的量以充满盖玻片下面的空间为宜，盖玻片下面不能有气泡存在，否则会造成计数不准。多余的藻液会流入H形的凹沟中。样品添加到计数池后，静置5min。使藻细胞沉降，否则，细胞呈悬浮状态，不处于同一平面上，给计数造成不便。待单胞藻全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察，仔细调焦，同时调节光栅，必要时调节光源和反光镜角度，直至细胞和纵横格线都清楚。计数并记录。如果规格为25格×16格的计数板统计计数池中央大方格内四角及中央中格内(即80个小方格)的单胞藻数，并记录。计数时，小心移动载物台，从上到下，由左及右又由右及左依次计数各小格内的细胞数。一般可采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理。凡压方格的上线和左线的细胞，统一算此方格内的细胞，而压方格的下线和右线的细胞，统一不算此方格内的细胞。如果一个小方格内单胞藻过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于单胞藻的计数。具体方法是：摇匀试管，取1mL单胞藻培养液，加入成倍的无菌水（消毒海水）稀释，稀释n倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有4—5个单胞藻细胞为宜。特别是在培养后期的样液需要稀释后计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，将计数板及盖玻片用流水冲洗，吹干，擦净，重复上述步骤，对每个样品计数三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算。n1-1n1-2N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算。n2-1n2-2N2=(n2-1+n2-2)/2N3=(n3-1+n3-2)/2计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算。n3-1n3-2N3=(n3-1+n3-2)/2将计数板及盖玻片用流水冲洗，擦干，重复上述步骤，对每个样品可计数三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2N=(N1+N2+N3)/3N3=(n3-1+n3-2)/2将同一样品的计数结果，取平均值。代入下式，求算单胞藻的密度：N小格平均每小格内的细胞数=N/(5×16)设每毫升中有x个单胞藻x个N小格×16×25个1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x个=N/(5×16)×16×25个1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x=N/(5×16)×16×25个×1cm3×1000÷(1mm×1mm×0.1mm)=50000N血球计数板的清洁计数完毕，将血球计数板用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。用擦镜纸包装后连同盖玻片一起放入原盒子内。16×25型的计数板每一个中央大格先分成16个中格，每个中格分成25个小格，但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。16×25型的计数板一般计数四个角的四个中方格（100个小方格）的细胞数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，将计数板及盖玻片用流水冲洗，擦干，重复上述步骤，对每个样品可计数三次，再取其平均值。将同一样品的计数结果，取平均值。代入下式，求算单胞藻的密度：平均每小格内的细胞数=∑四个中方格/4/25单胞藻密度（个/ml）=平均每小格内的细胞数×25×16×10000×稀释倍数