第八章动物实验质量控制

第九章动物实验质量控制第一节动物实验质量控制的意义动物实验是对演出型的一种影响处置。动物对实验处理的反应可用如下公式表示：R=（A+B+C）D+E。其中R表示实验动物的总反应，A表示动物种的共同反应，B表示品种及品系特有的反应，C表示动物的个体反应（个体差异）,D表示环境影响，E表示实验误差。由公式可以看出：A、B、C是由实验动物本身的遗传因素所决定的，而D是环境因素（包括实验处理），与动物的总反应呈正相关，故必须尽量减少D的变化，排除实验处理以外的影响，得到一个比较理想的实验结果R。动物实验是对演出型的一种影响处置。为了求得动物对处理结果的可信性和可重复性，就要求演出型的稳定，积极控制影响动物机体的遗传因素和环境条件。因此，对动物实验实行质量控制具有特别重要的意义。一、动物实验设计中的质量控制1.规划动物实验必须掌握学科专业知识,熟悉疾病的发病机理、临床体征、治疗用药、疾病转归以及有关检查指标等.2.规划动物实验还要较好地掌握实验动物学的知识，做好实验对象、处理因素和实验效应三个基本要素的设计。因此,成功的动物实验则是将医药学和实验动物学等学科知识有机结合，并使设计合理的课题得到正确实施的结果。在实验对象上，应正确选择实验动物，重点在遗传因素的控制；在处理因素方面，除了施加的实验因素和统计处理外，还包括实验环境、微生物和营养等实验条件的质量控制；实验效应即预期实验结果。例如研究某种终止早孕药物的作用，实验对象选择早孕大鼠，处理因素则为该药物并进行实验条件质量控制，而实验效应则为早孕终止。二、实验动物标准化实验动物的标准化是由实验动物生产条件的标准化、动物质量的标准化以及动物实验（应用）条件的标准化三部分组成。只有动物实验条件与生产条件相适应，才能保证标准化实验动物在整个使用过程中保持其标准化的价值，才不会发生高等级动物进入低等级实验环境中导致动物降级或降质的现象．因而，实验动物的标准化对动物实验研究结果的敏感性、准确性及可重复性具有重要影响。实验动物标准化与遗传、微生物和寄生虫、环境、营养等影响动物生长发育的因素关系密切，在实验动物繁育与使用过程中必须对这些因素进行严格控制，以保证实验动物和动物实验的质量。三、药品安全性研究规范和标准操作规程药品的毒性检测和安全性评价是新药研究开发所必须进行的基本程序。药品的安全性评价安排在临床研究前进行，主要采用实验动物作预测。由于影响结果的因素比较复杂，因而要保证实验数据和结果的可靠性、可重复性和科学性，就必须对实验动物选择、模型建立、试验设计与实施、检测技术、供试品与对照品的选择与保存、实验工作与数据记录、结果与结论的评价方法等作严格规范，对试验的全过程进行严格监督。对设施与仪器、人员配备与培训亦须严格要求。因此进行药品非临床安全评价研究规范（goodboratorypractice,GLP）体系建设非常必要，是提高新药研制水平、规范国际药品市场所必需。GLP是药物非临床安全性研究的指导原则，是解决“做什么”的问题，而与之对应的标准操作规程（standardoperatingprocedure,SOP）则是解决“怎么做”的问题，是保障GLP得以实现的具体方法和步骤。GLP管理规范已成为世界药品安全性评价的通行标准。第二节动物实验设计与分组一、医学科研工作基本程序医学科学研究就方法来说是提出假说、验证假说的过程，其工作程序是紧紧围绕这条主线进行的。医学科研工作基本程序如下1.提出假说、确定题目，是战略性决定。初始意念或提出问题→文献检索，调查访问→假说形成，提出设想→陈述问题，开题讨论．2.安排实验，验证假说，是战术组织。实验设计→实验观察→数据资料积累．3.总结工作，完成论文，是拿出战果。数据资料处理→统计分析→提出结论。二、动物实验设计应遵循的原则1.对照性原则：对照性原则是要求在实验中设立可与实验组比较，用于消除各种无关因素影响的对照组。对照应有可比性,即在“同时同地同条件”下进行.设立对照的正确方法是把研究对象随机分配给对照组和实验组.对照设立有两种方式,即自体对照和组间对照.自体对照是指在同一个体身上观察实验处理前后某种指标的变化,即把实验处理前的观察指标,作为实验处理后同一指标变化的对照.也可以把两种实验处理在同一个体身上进行一前一后地交叉比较.自体对照可有效减少个体差异对试验处理反应的影响.组间对照是指将若干动物以随机抽样的方法,将其分成若干平行组,随机挑选一组作为实验组,另一组作为对照组,进行比较.不作任何实验处理或给生理盐水进行比较的对照组称“空白对照”或“阴性对照”；施行正常值、标准值处理进行比较的对照组称”标准对照”或”阳性对照”.对照各组均应在同一条件下,否则失去对照意义.组间对照适用于需要多次进行实验观察的实验,有利于随时观察实验条件变化,判断试验反应强弱及显著性等.实验组与对照组例数相等时,统计效率最高.2.一致性原则:一致性原则是在实验中实验组与对照组除了处理因素不同外,非处理因素基本保证均衡一致.均衡一致是处理因素具有可比性的基础.为获得可靠的实验结果,最重要的是实验过程中保证实验组与对照组之间除被研究的实验处理因素有所不同之外,实验对象、实验条件、实验环境、实验时间、药品、仪器、设备、操作人员等等,均应力求一致.3.重复性原则:重复性原则是指同一处理要设置多个样本例数.重复的主要作用是估计试验误差、降低试验误差和增强代表性,提高实验结果的精确度,同时为体现结果的真实性,保证实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地重复出来,也需要足够的样本数.可按一般估测方法确定,也可通过统计学方法进行测算确定.兹介绍如下:3.1.一般估测的样本数小动物(大鼠、小鼠、蛙、鱼)每组10-30例,计量资料每组不少于10例,计数资料每组不少于30例；中等动物(豚鼠、家兔)每组8-20例,计量资料每组不少于8例,计数资料每组不少于20例；大动物(犬、猫、猪、羊等)每组6-20例,计量资料每组不少于6例,计数资料每组不少于20例.3.2按统计学方法测算的样本数现介绍一种动物实验的样本含量计算公式：n=2б2(tα+tβ)2/δ2式中，n为样本含量，б为标准差；tα取有显著性的t分布值，t0.05=1.96；tβ为无显著性的t分布值，1-β为实验检验能力，动物实验一般取1-β=0.80，t0.20=0.842；δ为处理组与对照组均值间的差异，可从预实验或文献资料库中获得。由上述参数可计算出正式实验所需样本含量。举例如下：给某种动物饲喂一种新型饲料，预实验中每月体重增长比原饲料增加30±15克（均值±标准差）。设显著水平为95%，检验能力为80%，则正式实验所需样本含量n为：n=2×152×（1.96+0.842）2/302=3.93即每组只需4只动物。由以上公式及有关计算可知，优化了实验操作，使获得的数据波动即标准差越小，实验结果的一致性越好，要求的样本含量就越少；处理组与对照组实验结果间的差异即δ越大，所需样本含量亦越少。从而有利于减少动物用量。样本含量多少尚与统计显著性相关，若提高显著性水平和检验能力的要求，则所需动物数量就得增多。4.随机性原则:随机性原则就是按照机遇均等的原则来进行分组.其目的是使一切干扰因素造成的实验误差尽量减少,而不受实验者主观因素或其它偏性误差的影响.随机化的手段可采用编号卡片抽签法、随机数字表或采用计算器的随机数值键等.5.客观性原则:动物实验设计中力戒主观偏性干扰,选择观察指标时,不用或尽量少用带主观成分的指标.结果判断要客观,更不能以主观的意愿对结果或数据作任意的改动和取舍.三、动物实验设计的基本类型1.单组比较设计单组比较设计是指在同一个体上观察实验处理前后某种观测指标的变化。此法的优点是能排除个体间生物差异，但不适用于在同一个体上多次进行实验和观察的情况。还应注意有时生理盐水等阴性对照下前后两次测量时一些指标也出现一定差异（如体重、血压等）。2.配对比较设计配对比较设计是指实验前将动物按性别、体重或其它有关因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对，配成若干对，然后将一对动物随机分配到两组中。两组动物的数量、体重、性别等情况基本相同，取得均衡进行实验，以减少误差及动物间的个体差异。3.完全随机化设计将动物随机分配到处理组及对照组做实验观察。先将动物按顺序编号，再用随机化工具，如查随机数字表，将动物分组。统计分析比较简单，抗数据缺失能力较强。其缺点是对非实验因素缺乏有效控制，只能依靠随机化方法来平衡有关因素的影响。故精确度较低，误差往往偏高。该方法适用于实验对象同质性较好的实验设计。4.随机区组设计在动物实验时，可将一窝小鼠或大鼠划为一个区组，确定数个区组后，按区组随机化原则将各区组的动物随机分配到处理组和对照组。注意每个区组的动物数量须与处理组要求的动物数量相等。若一窝仔数少于处理组数则不可采用，不能用别窝动物补充；反之，应将多余的动物舍弃，不得放于其他区组。由于同窝动物在遗传、营养、微生物携带上的一致性都较高，而各区组内每只动物接受何种处理是随机的，因而随机区组设计的均衡性好，可减少误差，提高实验效率，统计分析也较简易。其缺点是抗数据缺失能力较低。若一个区组的某个动物发生意外，那么整个区组都得放弃，或不得已采取缺项估计。拉丁方设计是指由拉丁字母所组成的正方形排列，在同一横行与同一纵列中都没有重复的字母，可进行不同横行或不同纵列之间对调，任意选择下面一种正方形排列方式。该设计适用于多因素的均衡随机，如比较某药与阳性、阴性对照组的作用，要求用4种药物编成A、B、C、D4个号码，再按4*4拉丁方进行，每个动物（纵列）没有重复使用的药物，同一日期（横行）也没有重复使用的药物，这样既能控制动物间的个体差异，也可避免了注射日期先后带来的实验误差,若样本是5、6个,则可采用5*5或6*6拉丁方等.1234123412341ABCD1CDAB1CBAD2BCDA2BCDA2BADC3CDAB3ABCD3ADCB4DABC4DABC4DCBA1,3两行对调2,4两列对调5.拉丁方设计6.正交设计正交设计是研究多因素试验的一种设计方法。其特点是利用一套规格化的表格—正交表来安排试验,适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长等一类试验的设计。在实验设计过程中只要根据试验条件直接套用正交表即可,而不需要另行编制。正交表在统计学书上都可查到,仅以L9(34)为例,说明其意义及使用方法.L代表正交表,右下角9字表示这张表需安排9次试验，括号内3表示这张表适用于三水平的试验,3的右上方指数4表示最多可以安排4个因素的试验，L9(34)的意思是,用这张表进行试验设计,最多可以安排4个因素,每个因素取三个水平,一共进行9次试验。常用的正交表中,适用于二水平试验的有L4(23)、L8(27)；适用于三水平试验的有L9(34)、L27(313)等,还有适用于四水平、五水平及水平数不等的各种正交表。选择哪一种正交表要根据试验的具体条件来决定。四、动物随机分组方法动物随机分组的方法很多,如抽签、拈阄等形式,但最好的方法是使用随机数字表或计算器。随机数字表上所有数字是按随机抽样原理编制的,表中任何一个数字出现在任何一个地方都是完全随机的。计算器内随机数字键所显示的随机数也是根据同样原理贮入的。随机数字表使用简单。假设从某群体中要抽10个个体作为样本,那么,可以先闭目用铅笔在随机数字表上定一点。假定落在第10行8列的数字22上,那么可以向右(向左,向下,向上均可),依次找37、48、65、90、69、13、85、84、98,把包括22在内的这10个号的个体按号作为样本,来作为研究总体的依据。使用计算器产生随机数时,每当按下2ndF(第二功能键)和RND（随机数字键)时,随机数就产生。产生的随机数值是0.000至0.999。显示的数前两个小数位用作一个样本个体,如输入2ndFRND显示为0.166,表明第十六个数据作为一个样本个体,重复按键操作,直到产生所需的样本大小。由于随机数是随机产生的,所以,绝对不会产生