精液分析的质量控制(陆金春)

1按照WHO5规范化评估男性生育力:精液分析的质量控制陆金春武警江苏总队南京医院2主要内容QC的概念精液分析QC的重要性质量控制的过程精子浓度、活力及形态学分析的质量控制精浆生化检测的质量控制抗精子抗体检测的质量控制质量控制的实施措施3质量控制（QC）即质量管理。实验室为了达到质量的要求，自行或由权威部门建立观察分析步骤的变异性，随时评估检测结果准确性的一系列相关制度。目的：寻找和发现检测分析过程中的误差和产生误差的原因，保持检测结果准确性的稳定。是达到质量保证（QA）的一种手段4QC的分类内部质量控制（IQC）：实验室内部所进行的QC。监测精确性，并通过控制限外的结果提示分析可能有缺陷。实施IQC的一种方式是将IQC材料与实验室常规工作一起检测，以使用质控图表监测这些材料的结果。外部质量控制（EQC）：不同的实验室就同一样本进行检测并对所得结果进行评估。EQC允许一个实验室的结果与其他实验室比较。其允许不同方法被评估，并以一定规格比较，其不可能仅在单一实验室进行。5QC的重要性保证不同时间同一实验室检验结果的一致性；保证不同实验室检验结果的可比性6质量控制过程分析前质量控制：精液样本的留取、接受、编号、保存等分析中质量控制：精液分析过程中的质控措施，如质控品、SOP、95%可信区间等分析后质量控制：报告的正确发出至临床医生做出诊断71.禁欲时间因素待做精液常规检查者的禁欲天数规定为2-7天。2.精液收集的完整性因素推荐采用广口容器为采精器皿，保证精液没有丢失。3.精液体积测量的准确性因素采用5版推荐的天平称重法计算精液体积（推荐使用自动去皮的精密度达0.01g的天平），这是获得一次射精的精子总数的关键步骤。分析前质量控制84.杂质的干扰因素使用第5版推荐的相差显微镜，相差显微镜这种高级光学系统能使精液中的大部分杂质与精子区分，使精子头部发光，杂质显示为灰色，这样可以过滤大部分的杂质。5.计数板间隙的准确性因素计数板间隙对浓度检测数据的准确性的影响巨大，常使误差达50%以上。计数板的深度按照5版要求每6~12个月必须校准一次。分析前质量控制9我们使用FilmetricsF20间隙测量仪分别对Makler（单池，19块）、Macro（单池，32块）、Geoffrey（双池，34块）、Glodcyto（四池，20块）、Leja（八池，20块）和Cell-VU（双池，20块）等6种精子计数池的深度进行精确测量，计算出每个计数池的平均深度、极差和变异系数（CV）以及每种计数池的平均深度、偏差及合格率。实验一10不论是10μm深的计数池（Makler、Macro、Geoffrey）还是20μm深的计数池(Glodcyto、Leja、Cell-VU)，没有一种精子计数池的深度是100%的合格。Makler、Macro和Geoffrey计数池的深度分别为（12.72±1.08）、（10.19±0.48）和（10.00±0.28）μm，Glodcyto、Leja和Cell-VU计数池的深度分别为（23.76±2.15）、（20.49±0.22）、（24.22±2.58）μm。Geoffrey计数池的合格率最高，为94.12%，其次为Macro（65.63%）和Leja（35%）计数池，其余三种计数池的合格率均为0。11我们利用Filmetrics间隙测量仪精确测量5种不同深度的Geoffrey精子计数池，然后按照WHO5手册的要求利用CASA分析高[标称值为50×106/ml]、低浓度[标称值为30×106/ml]的质控珠的浓度，以及31例精液标本的精子浓度。并分析不同精子计数池深度所得结果的相关性、相对偏差以及校正系数。实验二125种精子计数池的深度分别为8.1、9.1、10.2、11.1、11.9μm。不同深度的精子计数池计数的低、高浓度质控珠浓度结果均有显著差异（P0.01），但低、高浓度质控珠浓度与计数池深度均呈显著正相关（r均为0.997，P均0.01）。以10.2μm的计数板为基准（100%），5种计数板深度的相应校正系数分别为：1.26（10.2/8.1）、1.12（10.2/9.1）、1.00（10.2/10.2）、0.92（10.2/11.1）和0.86（10.2/11.9），校正后的各计数池相对偏差均低于5%。31例精液标本用不同深度的精子计数池进行检测，精子浓度结果类似于质控珠悬液。13在精子浓度分析中，精子计数池的深度非常关键，使用不合格的计数板，将导致检测结果产生误差，这种误差和计数板深度误差成正比。因此，精子计数板深度应该进行定期校验，并应以相应的校正系数对检测结果进行纠正。14我们利用Filmetrics间隙测量仪精确测量4种不同深度的Geoffrey精子计数池，然后按照WHO5手册的要求利用CASA系统分析36例精液标本的前向运动精子百分率（PR）、非前向运动精子百分率（NP）和总活动率（PR+NP），并进行比较分析。实验三154种精子计数池的深度分别为9.8、12.7、15.7和19.9μm，测得的PR分别为（44.00±11.63）%、（41.96±12.62）%、（40.86±11.71）%和（37.78±11.38）%，NP分别为（13.54±3.01）%、（14.13±2.94）%、（14.91±3.02）%和（16.53±2.77）%，总活动率分别为（57.53±11.06）%、（56.08±11.97）%、（55.78±11.55）%和（54.31±12.11）%。精子计数板深度与PR呈显著负相关（r=-0.993，P0.05），与NP呈显著正相关（r=0.989，P0.05），与活动率呈显著负相关（r=-0.978，P0.05）。尽管精子总活动率在4种不同深度的计数池之间没有显著差异，但PR和NP在9.8μm深的计数池和19.9μm深的计数池之间均有显著性差异（P0.05）。16精子计数池的深度对精子活力的影响不容忽视，不同深度计数池获得的结果差异将会给临床医生对患者做出正确的诊断（如弱精子症）和采取合适的治疗措施带来一定的负面影响。不同深度的精子计数池应有相应的精子活力正常参考值范围。176.检测时间和液化程度的影响检查精子活力，必须在精液完全液化后进行，最好在60分钟以内进行检测，以防止脱水、pH值或温度的变化对精子活力的有害影响。对射出60分钟后仍没有完全液化的精液，必须采取措施促使其液化，常用的方法是用注射器连接18号钝性针头反复缓慢抽吸，或加入等体积的培养液用加样器反复吹打，也可以使用菠萝蛋白酶消化。分析前质量控制18分析前质量控制7.充分混匀后取样为确保获得可重复的数据，在取样用于检测前，应充分混匀标本。当重复取样的结果一致时才能认可此测定值。混匀精液时不要太剧烈震荡而产生气泡。不要在漩涡震荡器上高速混匀，这样会损伤精子。建议使用盘式混匀器或三维混匀器。19精子浓度分析的质量控制20分析精子数为了获得可接受的较低的吸样误差，每次至少分析200条精子评价相同的计数池两次，或评价从单一稀释液充两次的池都不是真正的重复，由于其不能反映吸样、混合和稀释的误差21通过评估更多精子可以减小取样误差，但需权衡增加精确度与时间花费及因检测人员疲劳导致准确性下降之间的利弊。当至少计数400个精子时，抽样误差相对较小，约5%。精子计数与取样误差22稀释两份标本，分别计数，可接受差异见下表23表示存在计数错误或者取样误差，或者精液未充分混匀，以及在计数池上精子未随机分布。此时需要放弃第一次的两个值并重复评估（不要计数第三个样本，取3个值的平均值，或者取3个值中最相近的两个值的平均值）。对一些不常见的精液标本，如非均质的精液标本，甚至取第三批重复样本仍不能获得可接受差异值。在这种情况下，计算所有重复样本的平均值，并记录在报告中。当计数结果大于可接受差异24不同类型标本的处理方法高浓度精液标本运用CASA分析时，精子浓度高于50×106/ml的标本，由于精子之间的相互碰撞，会影响CASA的分析质量，为了保证CASA对于浓度分析的准确性，可对标本进行稀释。一般仪器对于50×106/ml—100×106/ml浓度的标本能够进行分析，但准确性不高，要发表论文或者质控要求高的实验室最好对高于50×106/ml的标本进行稀释。浓度超过100×106/ml的标本必须进行稀释25精子活力分析的质量控制26CASA较人工分析的优势用CASA（计算机辅助精液分析）分析精子活力，较人工方法具有两大优势：高精确性和提供精子动力学参数的量化数据（前向运动和超活化运动，即获能精子特征参数）。CASA分析视频记录的功能更容易实现标准化和更好地实施质量保证程序。27WHO第5版对评估精子活力的温度条件非常重视，要求每个实验室都必须标准化。虽然室温和37℃都可取，但我国幅员辽阔，各地气温相差很大，室内保温条件各不相同，唯有统一37℃的恒温标准才能使检测结果可以比较。WHO第5版提出：在37℃评估精子活力，保温板（计数板）应预热10分钟。最好在带有恒温载物台的显微镜下进行检查。同时标本也必须在相同的温度下孵育。28分析时要注意的细节1.加样后应静置5~15秒再检查，避免液体流动（漂移）影响判断。但最好在10分钟内检查完毕，防止温度变化和脱水等因素对精子活力的影响。2.为防止干燥影响观察精子活力的效果，应在距离盖玻片（实际可检查范围）边缘至少5mm的区域观察精子。3.为了避免重复观察相同的区域，最好根据精子浓度利用网格事先随机选择视野。在视野中界定的区域内要评估所有精子的活力。29活力质控必须解决的问题1.检测全程要采取有效的保温措施，使检测标本保持在37℃。2.必须使用高帧速率CCD实时记录精子运动的连续轨迹。3.规定计数板的间隙标准，统一精子的运动条件。4.利用视频录像（包括刻录软件和光盘）进行可重复的人工评估。5.高浓度样本要稀释。30精子形态学分析的质量控制31精子形态学分析操作的标准化精子形态学分析过程中的所有操作步骤都可能影响精子形态学分析的结果，如精液样本的洗涤、制片、固定、染色方法、显微镜质量、自动化分析系统的质量等。32正常形态精子判断标准的一致性精子头外形上应该是光滑、轮廓规则，大体上呈椭圆形，顶体区可清晰分辨，占头部的40%~70%，没有大空泡，并且不超过2个小空泡，空泡大小不超过头部的20%，顶体后区不含任何空泡中段应该细长、规则，大约与头部长度相等，中段主轴应与头部长轴成一条直线，残留胞浆不超过精子头大小的1/3；主段应该比中段细，均一，长约45um，可以自身卷曲成环状，尾部没有显示鞭毛折断的锐利折角。33α葡糖苷酶、ACP、Zn、果糖等严格的标准操作程序（SOP）标准液的吸光度相对恒定或定标室内质控品（每次与样本同时检测）精浆生化检测的质量控制34抗精子抗体检测的质量控制严格的SOP（加样、稀释、洗涤、孵育时间等）每次带有阴、阳性对照准备两种试剂，阳性样本复核阳性判断标准35QC的实施措施36QC样本来源购买——比较贵、缺乏，有靶值实验室制备——费用低，靶值未知精子浓度QC样本：乳胶珠、保存时间、聚集精子形态学QC样本：固定或染色玻片精子活动率QC样本：录像带、DVD视频、网格胶片精浆生化和AsAb的QC样本：中、低值精浆，阳性精浆37QC图——Xbar图38QC图的基本控制规则一个结果在控制线之外随机误差3个点中的2个在警告线之外系统误差5个点中的4个在警告线之外系统误差两个连续的结果均在上或下控制线之外系统误差两个连续的结果一个在上控制线外，一个在下控制线外随机误差8个连续的结果均在均值上或下系统误差39失控的原因样本不恰当的混匀（常见于粘稠的和有聚集的样本）技术人员紧张（如奇怪的吸样或记录误差）技术较差（如粗心的吸样或处理玻片或计数池充池）不恰当的培训（如精子计数鉴定的系统差异、正常形态的分类、来自计算错误的偏差）仪器误差（如磨损或未校正的自动吸样枪，不重合的显微镜