实验室猪精液品质检测新技术

精子密度检测估测法精子密度仪法和CASA法血细胞计数法主观性强，误差大＜一个精子为“密”＝一个精子为“中”＞一个精子为“稀”最准确，但速度慢滴上1滴稀释精液原精液200μL3%NaCl稀释10倍计数板上放盖玻片计数5个中方格精子将该数乘以50万方便、时间短、重复性好猪精子密度一般为2~3亿/ml生产上主要以精子密度仪法检测精子畸形率检测取中层精液抹片固定液固定20minGiemsa染色90min水洗并风干置1000倍油镜下观察精子＞300个畸形率检查方法相差显微镜直接观察伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察畸形率要求染色后显微镜观查影响：畸形率过高会减少精液的受精能力要求：一般要求不超过18%为宜改善：增加精液的用量可以提高其受精效果精子质膜完整性检测精子质膜染料分类精子不同区域质膜的检测目前主要的精子质膜检测方法精子质膜作用及分布1234精子质膜作用及分布维持完整的细胞内环境受精过程中起到信号识别与传导作用转运物质功能覆盖于顶体外膜区上的质膜覆盖于精子头部非顶体区的质膜覆盖于尾部的中段和主段部分的质膜作用分布精子质膜染色原理：此种染料不能进入质膜完整功能的精子内部，只能进入质膜受损的精子，并与DNA结合发出荧光。染色原理：活精子特异的荧光染料是膜通透性的染料，只能进入细胞膜完整的精子。Hoechst33342SYBR-14羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)羧基二甲基荧光素双醋酸盐(CMFDA)Carboxy-SNARF-1SYTO-17荧光染料死精子特异性荧光染料活精子特异性荧光染料非荧光染料伊红—苯胺黑染色伊红—苯胺蓝染色苔盼兰—吉姆萨染色碘化丙锭（PI）Hoechst33258溴化乙锭（EB）溴乙啡锭二聚体（EthD-1）Yo-Pro-1质膜染料分类精子质膜染料分类精子不同区域质膜的检测覆盖于顶体外膜区上的质膜覆盖于精子头部非顶体区的质膜覆盖于尾部的中段和主段部分的质膜荧光染料，例如碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）、DAPI、Hoechst33258等非荧光染料，例如伊红—苯胺黑染色、伊红—苯胺蓝染色等精子的低渗肿胀实验（HOST）检测通常与顶体外膜完整性的检测联合起来进行原理：低渗溶液中，有生物活性的精子质膜会使水分子进入质膜中，直到精子内外环境达到平衡为止。水的内流使精子尾部的质膜膨胀并且尾部会发生弯曲。但是精子质膜损伤或失去生物活性，水能够自由通过质膜，在胞质内不会积聚液体从而不会出现肿胀和尾部弯曲。通过相差显微镜可以观测到精子质膜对低渗液的反应。精子质膜检测方法利用显微镜进行检测ＡＢＣＡ：被PI染色的死精子，为红色；Ｂ：被SYBR-14染色活精子，为绿色，膜功能完整；Ｃ：被SYBR-14／PI染色，绿色为膜完整的活精子，红色为死精子。红箭头所指区域为被PI染色的死精子；蓝箭头所指区域为被SYBR-14染色活精子；利用流式细胞仪检测线粒体功能检测精子线粒体检测方法检测线粒体的染料分类12检测线粒体的染料分类染料名称染色特性优缺点R123（Rhodamine123）MITO（MitoTrackerGreenFM）JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide）能渗透并沉积在正常线粒体上发出绿色荧光。如果线粒体损坏则不发绿色荧光。MITO在水溶液中不发荧光，而当积聚在线粒体内时会发绿色荧光。线粒体膜电位低时，发绿色荧光；膜电位高时发橙色荧光在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。MITO在精子头部有非特异性染色。JC-1染色的特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。精子运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供精子线粒体检测方法检测方法：1.荧光显微镜2.流式细胞仪最适合的荧光染料：JC-1荧光显微镜检测：a：R123染色，在精子头部和尾部有非特异性染色，可检测线粒体有无功能，不能区别膜电位高低。b：JC-1染色，其特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光。c：MITO染色，在精子头部有非特异性染色。流式细胞仪检测：A：R123/PI染色，箭头指发绿色荧光精子；B：JC-1/PI染色，顶端箭头指发橙色荧光精子；底端箭头指发绿色荧光精子；C：MITO/PI染色，箭头指发绿色荧光精子；A-C，未被箭头标记的精子属于死精子，被PI标记。ABC获能和顶体检测顶体检测获能检测精子膜的获能状态的改变很容易引起顶体反应的提前发生，以及精子受精能力的丧失1.顶体反应是精子成功穿入卵母细胞所必需的过程。2.顶体内富含多种蛋白水解酶（顶体酶），在精子穿过卵子放射冠、透明带等受精过程中发挥主要作用。一二获能检测采用金霉素（CTC）进行获能检测CTC进入精子可以结合游离的钙离子，这些CTC-Ca2+复合物能够结合在质膜的疏水区并且在荧光显微镜下激发出黄绿色荧光①F型，整个精子头部有均一荧光，为未获能，顶体完整的精子；②B型，精子头部顶体后区，在靠近尾部的部分无荧光或非常弱的荧光，而头前部为均一荧光，为获能且顶体完整的精子；③AR型，整个精子头部无荧光或非常弱的荧光，为顶体不完整的精子，即发生了顶体反应的精子或顶体缺损的精子。①②③顶体检测A)A)H33342标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光；B)PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光；C)发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA标记,呈现绿色顶体。荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态B)C)流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态A)绿箭头所指区域属于PI标记精子，为死精子；B)蓝箭头所指代表FITC-PNA标记精子，为顶体反应精子；C)黑箭头所指代表未发生顶体反应活精子。染色质完整性检测1.插入没变性的双链DNA的AO染料发绿色荧光；2.与变性的单链DNA结合的AO染料发红色荧光；3.黄色跟橙色为正在变性的DNA。原理：DNA的变性位点具有感光性，用异源性的染料AO染色，在荧光的激发下，插入没变性的双链DNA的AO染料发绿色荧光，而与变性的单链DNA结合的AO染料发红色荧光。吖啶橙（AO）染色，进行染色质结构试验（SCSA）１１１１２２２２３３３３透明带结合检测检测方法目前检测精子结合透明带能力有两种方法：透明带结合检测（ZBA）半透明带检测（HZA）卵母细胞与精子共同培养，然后使用相差显微镜或者荧光显微镜计算结合到透明带上的精子数量利用显微操作方法将卵母细胞切割两半，并去掉细胞质。然后两半透明带分别与对照组和实验组的精液样本孵育，最后使用相差显微镜计算结合的精子数量ZBAHZA体外受精检测更能够接近体内的受精过程更好的检测精子的真实质量部分动物体外受精技术并不成熟费时费力实验条件复杂成本过高优点缺点卵母细胞体外受精(IVF)技术已经很成熟，可以利用IVF技术来检测精子的受精能力。实验室评估与精子质量、受精之间的关系受精能力膜IVF顶体HZA活力活力与受精能力之间具有可变的相关性。r=0.15~0.83（Kjaestadetal.,1993；Januskauskasetal.,2003）膜的完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性r=0.05（Almetal.,2001）；r=0.39~0.57（Januskauskas,2001）顶体与受精能力之间具有显著的、可变的相关性r=0.60-0.84（WithfieldandParkinson1995；Januskauskasetal.,2000)体外受精（IVF）与受精能力之间具有显著的相关性r=0.35-0.59（Zhangetal.,1997；Schneideretal.,1999）精子与透明带的结合能力与受精能力之间具有显著的相关性r=0.50（Zhangetal.,1998）实验室差异生产操作差异母畜差异实验室对精子分析评估时，在客观性、可重复性以及准确性上存在差异。人工授精操作差异、不同的季节以及输精量等不同，都会造成受精结果的差异。母畜方面，体质、年龄胎次的不同以及饲养管理的差异，均会影响到人工授精的效果。精液品质分析及受精效果变化的原因分析差异精子只有在结构和功能上具备多方面的特性才具有受精能力。单一指标不能完全反映其受精能力，需多指标同时进行。展望精子检测的主要目的就是快速、准确地确定其受精能力，以满足科研及生产的需要。传统检测方法虽然比较简单，但存在主观性、可变性、检测指标与受精能力相关性差等缺点。因此应推广新技术用于精液检测。精子需要同时具备多种特性和功能才能具有受精能力，因而单独的检测指标无法完全反映其受精能力。同时检测多个指标，才能更好地反映精子的受精能力。精子质量评估未来的研究方向仍是继续寻找有效的预测精子受精能力的检测指标与方法。