家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究

项目名称：家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究首席科学家：夏庆友西南大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：重庆市科委教育部一、关键科学问题及研究内容1．拟解决的关键科学问题根据国家蚕丝产业发展重大需求和蚕业科学发展长远需要，以“十一·五”家蚕“973”项目研究为基础，“十二·五”期间紧紧围绕家蚕关键品质性状，重点解决如下两个关键科学问题：第一：家蚕关键品质性状形成的分子机理家蚕因食桑产丝，才可供人类利用，其关键品质性状主要有三：第一，丝蛋白合成与分泌机制。丝蛋白的组成和结构特征，决定了蚕丝关键品质性状。研究表明，家蚕丝的各种工艺性状，包括纤度（茧丝直径）、茧丝长度、净度（茧丝表面结构）、强伸力、抱合力以及解舒性能（丝胶溶解性）等，均受丝腺合成与分泌机制所调控；第二，发育变态与调控。家蚕是典型的完全变态昆虫，现行蚕桑生产体系，无不是根据家蚕生长与变态发育特征来安排。特别重要的是，家蚕生长与发育特征（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量，整体上决定了家蚕的蚕丝生产特性；第三，对疾病的抵抗性。家蚕经过数千年人工驯化，尽管获得了适合群居饲养和发育整齐等有利于生产的特性，同时也有大规模易受病原微生物感染的不利性状。尽管蚕桑生产过程中的疾病防控受到高度重视，但每年蚕农因蚕感病造成的损失仍然高达25％，并且高居不下。上述三个生理过程（或性状），是家蚕诸多影响蚕丝产量和品质中最为关键且相互联系的因素，决定了蚕丝生产的整体水平与效益，是本项目将要解决的第一关键科学问题。在前一个项目中，家蚕性别决定、丝蛋白合成、发育和免疫等四大性状是作为其中的一个课题来布局的，并打开了关键的突破口。本期项目把性别决定之外的三个性状上升为三个课题，同时布局家蚕干细胞与不同组织器官变态发育过程中的分子基础研究，因为干细胞与组织器官再生与家蚕丝腺发育、变态发育和免疫防御有着重要的密切关系。根据已有基础，家蚕关键品质性状形成分子机理研究的具体科学问题分别如下：蚕丝蛋白合成机理研究将着重解决丝蛋白基因的分子调控问题。家蚕幼虫期共食下鲜桑叶约22g，丝腺合成并分泌约0.5g丝蛋白。研究表明，家蚕丝蛋白合成调控有三大主要特点，一是蚕丝合成高效性：家蚕丝腺功能高度特异化，类似果蝇唾液腺，而丝蛋白质的合成主要由数目极其有限（140余个）的分泌细胞完成，这些细胞的细胞核内染色体高度多倍化，可达到50~100万单倍基因组。二是部位特异性：蚕丝由家蚕体腔内左右对称分布的一对丝腺所合成，每条丝腺分前部、中部和后部三个功能区域，后部和中部分别特异合成家蚕丝素蛋白和丝胶蛋白等茧丝纤维的主要结构成分；这种部位特异性决定了蚕丝各组分，尤其是有效组分丝纤维的所占比例和加工特性。三是时间特异性：家蚕丝腺细胞分化于胚胎发育时期，尽管早期幼虫的蜕皮期能够合成少量蚕丝蛋白，但大量合成丝蛋白并形成丝纤维却是在末龄幼虫第3天开始，具有严格的时间调控。因此，阐明蚕丝品质性状机理，主要的科学内涵是回答上述三个特性的分子调控机制。前期研究表明，丝蛋白编码基因的转录和翻译机制是决定丝蛋白合成机制的关键因素。通过丝腺特异基因的大规模鉴定和功能研究，初步发现丝蛋白编码基因受两大信号通路的调控。一是激素信号通路，主要调控基因转录的时间特异性；二是受发育主控基因，即高度保守的同源异型盒（Homeobox）类转录调控因子所调控，主要决定丝蛋白基因表达的空间特异性。为此，本期项目将重点研究fib-H、fib-L、P25和Ser1～3等主要丝蛋白编码基因受激素信号和发育主控基因的调节机制，以期系统阐明丝蛋白合成分子机理及其与蚕丝品质之间的相互关系。激素和营养信号传导与变态发育调控研究着重解决信号传导机制。与其它全变态昆虫一样，家蚕的变态发育主要受激素（神经肽激素、蜕皮激素、保幼激素和类胰岛素等）和营养（氨基酸、糖和脂肪酸等）的协同调控。目前知道，当家蚕从一个龄期幼虫向下一个龄期幼虫转变时，往往同时有高水平的蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）分泌，使得昆虫不会发育成蛹或成虫（蛾）。而在幼虫向蛹期发育时，体内有高水平的蜕皮激素，但保幼激素水平下降，使得幼虫向蛹期变态发育。因此认为，蜕皮激素控制着昆虫的蜕皮与变态发育进程；而保幼激素则调控着昆虫发育的方向。所以，蜕皮激素和保幼激素信号传导系统及其相互作用是变态发育的核心问题。而家蚕生长与发育特征（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量。因此，激素和营养信号传导对变态发育的调控将极大地影响着蚕丝产量和品质。本项目前期研究发现，家蚕共计有87种神经肽激素、激素受体和激素调节相关基因；鉴定出18种对20E敏感的受体和受体型转录因子。此外，神经肽激素基因，包括滞育激素（DH）、信息素生物合成激活神经肽（PBAN）、脂动激素（AKH）、羽化激素和家蚕素（4K-PTTH）基因也被鉴定。在前一期项目重点开展了家蚕JH和20E合成代谢途径及信号传导途径相关基因的鉴定和功能初探的基础上，本期项目将以丝腺、脂肪体、中肠和表皮等组织器官为主要研究材料，重点研究昆虫变态发育的激素信号传导主要途径和关键调控分子的作用，揭示激素与营养信号与组织器官退化和再生的关系，建立比较完整的家蚕变态发育激素与营养调控的理论体系和机理模型，以期阐释昆虫变态发育这一重大的科学问题。干细胞与家蚕变态发育的组织器官再生机理研究着重解决成虫组织器官形成中的干细胞生物学行为变化及调控机制。家蚕变态发育期一般指5龄末期幼虫至成虫羽化阶段，包括幼虫-蛹和蛹-成虫（蛾）的变化过程。在变态过程中，幼虫专性组织如前胸腺、丝腺等迅速退化消亡，中肠、神经和脂肪体发生结构和功能的转变，翅原基、胸足原基和生殖腺细胞组织快速分化生长，并发育为成虫的器官组织。有关果蝇的研究表明，干细胞在变态发育期多种成虫组织器官分化形成过程中扮演着至关重要的角色，受到复杂的各种信号分子网络的调控。干细胞与组织器官再生不仅与变态发育有密切的关系，与丝腺发育和免疫防御也有着重要的关系。前期研究我们首先关注了家蚕中肠干细胞的鉴定与分化调节，在筛查家蚕中肠干细胞分子标记和鉴定变态发育过程中的家蚕中肠干细胞等方面取得突破进展。本期项目将以中肠、血液、神经、脂肪体、翅原基等组织器官为主要材料，系统研究这些组织器官在家蚕变态发育中分化形成与再生重建的干细胞分子基础，鉴定目标组织器官的干细胞，揭示干细胞在相关组织器官形成或重建过程中的自我维持与分化行为，阐释干细胞分化为相关组织器官的分子调控机制，这是在分子细胞生物学水平阐明昆虫变态发育这个重大科学问题的关键。家蚕免疫调节与抗性机理研究将着重解决宿主对病原微生物的模式识别问题。昆虫体液免疫在抵抗病原微生物侵染中发挥着最重要的作用。昆虫体液分子免疫系统主要由模式识别、信号传导和效应因子表达三个部分组成。前期项目主要通过基因组分析和微生物诱导实验，基本查明了家蚕体液免疫信号传导过程的关键基因，系统鉴定了家蚕抗菌肽效应因子的组成和功能。研究发现，家蚕的免疫相关基因和信号传导途径比较保守，与模式生物果蝇的Toll和Imd两种先天免疫信号途径应答基本一致，但家蚕效应因子体系与果蝇相比又具有一定的特殊性。前期项目还对Toll信号途径中的Toll受体、Spätzle、MyD88和Tube等，Imd途径中的Imd、FADD、IKK和relish等关键基因进行了深入研究。作为免疫应答的前哨，昆虫病原模式识别受体是激发免疫信号传导通路和效应因子产生的关键。昆虫对不同的病原物具有高度特异的模式识别，剖析昆虫病原物的模式识别，也是阐明和提高家蚕抗病性的重要靶标。在前期项目系统鉴定信号传导和免疫应答体系的基础上，本期项目将重点研究家蚕对不同专有性病原微生物的模式识别分子，以及它们在启动免疫信号通路中的具体功能，以期阐明家蚕重要病害形成的机制，寻求新的防御措施。丝蛋白合成的分子调控作为昆虫特异基因调控的研究模式，对昆虫发育和分子生物学的基础研究将提供重要补充作用；激素信号与变态发育调控、干细胞与变态发育的组织器官再生机理，以及免疫分子机制，更是昆虫基础科学研究的前沿和热点。因此，这几个方面的科学问题相互联系，不但作为家蚕关键品质性状对蚕丝业生产举足轻重，而且也作为昆虫基础科学的重要领域，对整个昆虫学研究发展和害虫防治新策略的产生都具有十分重要的意义。第二：家蚕分子育种理论基础与技术体系在“十一·五”家蚕“973”项目的支持下，许多与重要经济性状相关功能基因得到鉴定，遗传素材创新基础平台建设也已经初具规模。系统研究家蚕分子育种的理论体系，并建立相应的技术平台，培育高产优化的家蚕品系，成为下一个五年计划必需解决的重点问题。家蚕分子育种理论体系亟需着重解决分子改良靶标和实现思路。家蚕自野蚕经人工选择和驯化而来，与野蚕祖先相比，家蚕的产丝性能提高近10倍。1930年代开始利用一代杂种优势，蚕丝产量比饲养纯种又提高了近20％。自此，家蚕生产能力达到了一个难以逾越的高峰，使得其后近80年间未见革命性突破。与其它植物或动物生产一样，家蚕品种也正处于分子改良甚至系统分子育种的前夜，新的突破机遇需要坚实的理论基础。现有遗传资源中本身就存在着大量发育、变态和抗性突变系。如前所述的三个关键性状中，家蚕激素调节与免疫性状实现分子育种的靶标位点相对较多，而蚕丝蛋白合成调节的靶标位点相对较少。初步研究成果表明，通过调节丝腺发育和丝蛋白编码基因转录，可能是实现丝产量和品质改良的有效途经。本期项目将以前述家蚕几个关键品质性状的分子解析为基础，建立家蚕分子育种的基本思路和策略，为家蚕品种的分子改良奠定坚实的理论基础。家蚕分子育种技术体系着重解决遗传互作和基因敲除技术的建立。从基因层面讲，分子育种无外乎有两个技术途经：一是已有基因功能的加强甚至新功能的导入；二是已有基因功能的减弱甚至彻底丧失。通过前期项目研究，建立了比较稳定和有效的家蚕转基因技术体系，以及系统RNAi、GAL4/UAS转基因等分子遗传操作方法。但是，从家蚕分子育种的技术储备和现实要求而言，还丞需建立和完善遗传互作和基因敲除等关键技术。为此，本期项目将着重解决：克隆不同发育时期和组织器官的特异启动子或顺式作用元件，建立多个GAL4转基因系，以实现目的基因的时空特异转录调控；利用UAS使目的基因功能加强或获得新功能，并整合RNAi使目的基因功能消弱或丧失；研究建立2个UAS元件控制2个基因的遗传操控及其互作：2个基因同时获得功能、2个基因同时丧失功能、1个基因获得功能而另1个基因丧失功能；结合GAL4/UAS转基因和FRT-FLPmosaic技术，建立Flp-outmosaic方法，分析在任一组织、任一发育时期基因获得功能或丧失功能的细胞与外周野生型细胞的差异。家蚕中至今尚未实现基因的有效定向敲除（knockout）和敲入（knockin），本期项目将通过锌指核酸酶等方法建立家蚕基因定向敲除和敲入技术，通过对分子靶标的操控实现家蚕基因组的有效和定向编辑，为家蚕关键品质性状基因功能研究和分子改良与素材创新搭建关键技术平台。2．主要研究内容围绕以上两个关键科学问题，计划从三个方面开展研究：（1）家蚕重要功能基因的定位克隆前期项目已经建立了家蚕突变基因定位克隆平台技术，以此为基础，本期将重点围绕家蚕丝品质、变态发育和抗性性状，定位克隆研究重要的突变基因，在布局上将分解到三个品质性状相关的课题开展研究。开展此研究的主要目的在于保持前沿探索，不断推动家蚕功能基因组研究的长期和可持续发展。（2）家蚕关键品质性状的分子解析从基因层面解析家蚕丝蛋白合成、激素调控与变态发育、干细胞分化与组织器官形成以及分子免疫的分子机制，是本项目的核心和重点之一。因此在布局上，三个关键性状以及干细胞分化与组织器官形成均单独列为课题开展研究。丝蛋白合成研究将围绕家蚕丝素重链基因（fib-H）、轻链基因（fib-L）、丝胶基因（Ser1~3）和P25等蚕丝主要结构蛋白编码基因的转录调控机理展开，重点研究包括丝腺细胞发育与功能分化，丝蛋白编码基因表达与激素信号的相互关系，