抗核抗体检测的质量要求及结果的合理判读(李晓军)(2)

抗核抗体检测的质量要求及结果的合理判读李晓军南京军区南京总医院全军临床检验医学研究所自身免疫性疾病自身免疫病(Autoimmunediseases,AID)主要病理基础：----血清中存在有一种或多种针对自身组织成份的抗体标志物及自身反应淋巴细胞致病机制：----自身抗体和自身反应淋巴细胞在AID的发病过程中起重要作用1)体液免疫：由自身抗体介导→Ⅱ、Ⅲ过敏反应导致的组织损伤2)细胞免疫：自身反应性T细胞介导的细胞毒作用3)二者共同参与：抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）4)……自身免疫病的系统受累AID的类型：1）器官特异性AID2）系统性AID（非器官特异性）AID主要特征：1）相关的临床症状2）ESR增高,血清Ig↑,自身抗体、CIC阳性,血清补体(C3、C4)活性降低3）有病变且病变处存在有与自身抗原分布相关的免疫活性细胞或抗体4）将相关抗原给动物注射时能重复出类似人的疾病，当被动输入淋巴细胞或抗体时可将疾病从患病动物转移给正常动物自身免疫病的“病谱”器官特异性非器官特异性桥本甲状腺炎扩张性心肌炎自身免疫性溶血性贫血系统性红斑狼疮原发性粘液水肿恶性贫血特发性血小板减少性紫癜干燥综合征甲状腺机能亢进自身免疫性胃炎特发性粒细胞减少症类风湿关节炎Addisino病1型糖尿病重症肌无力多发性硬化症脱髓鞘疾病寻常型天疱疮类天疱疮自身免疫性肝炎原发性胆汁性肝硬化原发性硬化性胆管炎溃疡性结肠炎克罗恩病自身免疫性肾小球肾炎肺肾出血综合征绝经过早（少数病例）男性不育（少数病例）交感性眼炎晶状体源性葡萄膜炎硬皮病多发性肌炎/皮肌炎混合性结缔组织病系统性血管炎抗磷脂综合征药物性狼疮自身免疫病共同特征1.病因不明2.女性居多，发病率随年龄增加而增加3.有遗传倾向4.患者血清中有多种自身抗体或自身反应性致敏淋巴细胞5.疾病有重叠现象，即一个病人可同时患一种以上自身免疫病6.病程一般较长，多迁延为慢性7.病损局部可发现淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞等浸润8.免疫抑制剂治疗可取得一定疗效自身免疫病主要实验检查自身抗体免疫球蛋白补体淋巴细胞细胞因子自身抗体与临床疾病的关系天然自身抗体：维持机体内环境稳定靶抗原：肌动蛋白、肌球蛋白、角蛋白、DNA、胶原、Ig、细胞因子等，多为IgM型、低滴度；病理性自身抗体：在免疫风湿病的发病过程中起重要作用1）诊断、鉴别诊断：抗dsDNA、抗Sm抗体与SLE；抗CCP与RA；AoAb与、女性不育、流产有关者2）疾病监测、预后判定：抗dsDNA为SLE疾病活动标志自身抗体的特性自身免疫性疾病的重要标志高滴度存在于自身免疫性疾病患者与疾病的活动性相关参与免疫病理性损伤常检测的自身抗体抗核抗体（ANA）抗可提取性核抗原抗体（A-ENA）抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）类风湿因子（RF）抗角蛋白抗体（AKA）抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）抗核抗体（ANA）抗核抗体:针对真核细胞（HEp-2、肝细胞）各种核成分靶抗原的自身抗体的总称。抗核抗体（ANA）抗DNA抗体（anti-dsDNA，anti-ssDNA）抗组蛋白抗体（histones:H1,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B）抗ENA（抗:Sm,nRNP,SSA/Ro,SSB/La,rRNP,Scl-70,Jo-1,PCNA,.…）ANAs抗非组蛋白抗体抗着丝点抗体（anti-CENP-A,B,C，D，F，G）抗核仁抗体抗其他细胞成分抗体（高尔基体，中心体，纺锤体，线粒体，溶酶体，肌动蛋白，Vimentin，细胞角蛋白，Lamin…)1.2.3.4.抗核抗体谱的分类和命名以首先检出该抗体的患者名字命名，如抗Sm、抗Sa抗体等；以相关疾病命名，如抗Scl-70、抗SS-A、抗SS-B抗体等；以抗原的部位命名，如抗核仁抗体、抗线粒体抗体、抗核膜抗体、抗细胞浆抗体等；以抗原的化学名称分类命名，如抗DNA、抗RNP、抗组蛋白抗体,抗核小体抗体等。常规临床诊断ANA种类:数十种新自身抗体和检测方法:陆续被引进临床实验室为临床医生提供更多的选择和诊断指标另一方面也带来一定的困惑?如何根据患者病情挑选具有诊断价值的最佳自身抗体组合?如何选择合理的检测方法，并对结果作出正确的判断?将为患者得到及时准确的诊断和治疗发挥至关重要的作用!免疫检验工作者的目的:广泛向临床医生宣传有关ANA项目及其检测技术的价值及其限制，宣传ANA选择的适应征及有效性，从而对检测结果作出科学合理的判读。保证检测结果的可靠性和准确性让临床医生了解各种测定方法的特性包括方法的精确度、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值、似然比等，关系到医生如何准确地选择这些检测项目服务于患者，并合理地利用资源。敏感性（sensitivity）特异性（specificity）敏感性:某检验项目对某病具有鉴别、确认的能力患者阳性结果的百分比特异性:某检验项目排除无某病的能力非患者阴性结果的百分比敏感性和特异性取决于所选用的cut-off值某法敏感性越高，特异性就越低，反之亦然应优选能获得最佳敏感性和特异性组合的cut-off值敏感性和特异性并不能告诉医生阳性结果的个体是否患某种疾病，阴性结果的个体是否不患某种疾病而临床医生关心的是，ANA阳性者中有多少是CTD患者；ANA阴性者中有多少不是CTD患者。PPV和NPV即回答这一问题阳性预测值（PPV）阴性预测值（NPV）PPV：试验结果阳性者中真正患病的概率NPV：试验结果阴性者中未患病的概率PPV和NPV是临床试验中对试验有用性的正确评价指标PPV和NPV受人群患病率的影响：患病率↓：PPV↓，NPV↑理想的ANA试验：高PPV：大部分阳性结果者是CTD患者高NPV：大部分阴性结果者不患CTDANA检测的选择原则临床医生选择ANA检测的目的：1）在有典型症状患者中作出CTD的诊断2）在症状不确定患者中排除CTD的诊断3）明确CTD的类别4）判断病情活动度ANA检测的选择原则通常原则:１）首先采用以HEp-2细胞为基质片的IFA作为筛查实验，以有效地排除CTD的存在２）ANA阳性→进一步检查抗ds-DNA或抗ENA抗体，以期对CTD作出特异性地诊断。３）不主张单独用抗—ENA抗体作为筛查实验ANA免疫学测定方法琼脂双向扩散或对流免疫电泳-----抗ds-DNA，抗Sm，抗U1RNPFarr试验：抗ds-DNA间接免疫荧光技术：细胞内抗原自身抗体检测的“金标准”(筛查)-----抗核抗体(ANA)、抗ds-DNA抗体、抗平滑肌抗体(ASMA)、ANCA等酶联免疫吸附试验(ELISA):自身抗体确认免疫印迹＆免疫斑点技术:自身抗体确认-----ENA多肽抗体谱、AMA(M2/M4/M9)、抗LKM-1、抗LC-1、抗SLA/LP等微阵列免疫芯片技术悬浮芯片技术IFA－ANAIFA－筛查ANA有效的“金标准”基质片抗原：鼠肝匀浆组织↓敏感性差，不能测出抗SSAHep-2细胞↓阳性检出率高Ro60cDNA转染Hep-2细胞（Hep-2000TM）可显著提高检测抗SSA/Ro抗体的敏感性1)IFA－ANA如何鉴别假阳性现象(滴度,核型)?血清稀释度：1:40：健康人ANA＋％高达30%；1:160：＋％则仅5%高滴度的ANA阳性结果方有诊断意义2)核型:3)A-ENA:健康人A-ENA常为阴性Mariz.ArthRheumatol,2011,63:191ANA-IFA核型有助于区别正常人ANA+和ARDANA+?密而细颗粒型抗核膜抗体(抗板层素抗体)荧光模式:在核膜区呈现线状荧光,中心区域荧光强度弱(Hep-2),而肝细胞片:中心区域发暗,无荧光,此点可与核均质荧光相区别.靶抗原:包括60kD,68kD和74kD3种蛋白组分,与中间丝相关,以网状形式包被在核内膜的内部.相关疾病:慢性活动性自身免疫性肝炎的活动期.ANA(均质型)荧光模式:Hep-2细胞:间期细胞核阳性,呈均匀的荧光;核仁与核浆一样呈强度相同的均质荧光;分裂期染色体阳性(增强),亦呈均匀的荧光.肝细胞片:肝细胞核阳性,呈均匀的荧光,与Hep-2细胞的荧光强度一致.主要相关自身抗体:抗ds-DNA,核小体和组蛋白抗体等.EUROIMMUN粗颗粒型抗RNP/Sm抗体荧光模式:§Hep-2细胞:间期时,整个细胞核呈现粗颗粒,但有时也出现中等到细的颗粒荧光,核仁为阴性;在分裂期细胞中,浓缩的染色体部位为阴性,而外周区几乎为均质型、光滑的荧光.§灵长类肝组织切片:细胞核亦呈现颗粒型荧光,核仁为阴性,荧光强度与Hep-2细胞相同.细颗粒型抗SS-A/SS-B抗体荧光模式:§Hep-2细胞:间期细胞核呈现细颗粒型荧光,核仁有部分不发荧光。分裂期细胞在染色体以外显示颗粒荧光,而染色体本身则不发荧光.§灵长类肝组织切片:肝细胞核及部分核仁可见细颗粒荧光,细胞浆不发荧光.§在某些细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞）中的荧光反应较强EUROIMMUNANA常见核型与疾病关系DiagnosticPathology2009,4:1ANA临床诊断CTD特性DiagnosticPathology2009,4:1ArthRheumat,2002,47,pp434–444ANA(+)临床诊断意义对疾病诊断非常重要SLE、系统性硬化病对疾病诊断有一定作用干燥综合征、多发性肌炎-皮肌炎对监测预后非常重要幼年型慢性关节炎、雷诺现象疾病诊断标准的重要组成部分药物引起的狼疮、混合性结缔组织病对疾病诊断、监测预后没有作用类风湿性关节炎、多发性硬化症、甲状腺疾病、传染病、特发性血小板减少性紫癜纤维组织肌痛IFA法检测ANA时应注意的问题ANA滴度和荧光图谱不能作为判断抗体特异性的标准，结果阳性时应进一步作特异性抗核抗体项目的检查．IFA限制:*ANA(-)，抗ds-DNA(+)，抗ENA(+)→技术误差SLE特殊类型*某些ANA(抗SSA/Ro、抗SSB/La)用IFA难以测出*Jo-1抗原属于胞浆抗原，IFA检测ANA阴性时不能排除抗Jo-1的可能IFA法检测ANA时应注意的问题如果临床高度怀疑CTD，应同时做ANA和抗ENA抗体，即使ANA(-)，也要进行抗ENA抗体的检测，否则会漏检一些ANA如抗SSA/Ro、SSB/La或抗Jo-1抗体。IFA法检测ANA时应注意的问题由于目前国内缺乏合适的质控品，检测结果在实验室间很难做到标准化。每个实验室必须规范化各自的操作规程，确立各自的cut-off值，使判断标准兼顾到诊断敏感性和诊断特异性的平衡。应该参加当地或国家的室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）计划。目前，国际上已有抗核抗体的标准参考品结果解释应密切结合其他临床指标ANA室间结果很难具备可比性15个国际Lab同时用HEp-2-IFA进行ANA的检测，所获得的平均变异系数（CV）值如下：1:401:80室内CV（%）16.513.1室间CV（%）50.744.31:16012.237.91:32012.836.0每个实验室应根据各自情况，建立本室的cut-off值，以确保实验结果的精确性和可比性部分自身抗体的国际参考品参考品WHOWo80WHO1064特异性dsDNA100IU/ampoule均质型ANA100IU/ampouleMRC参考品A均质型ANA100IU/ampouleWHO1063WHO1061CDC参考品nRNPIgMANA100IU/ampouledsDNA、La、U1-RNP、Sm、Ro、中心粒、Scl70、Jo-1抗ds-DNA检测抗ds-DNA与SLE及狼疮性肾炎的发生及其活动程度密切相关。检测常用短膜虫IFA（CLIF）、Farr试验和ELISA技术。Farr试验是经典的特异性检测方法，但可测出高亲和力的IgM类抗ds-DNA。目前临床推荐使用的是测IgG类抗ds-DNA的ELISA和CLIF单链DNA,变性的DNA(嘌呤和嘧啶碱基)双链DNA,天然DNA(氧核糖核酸骨架)相关疾病:风湿病:ssDNA:SLE:80.8%;Sjögren‘s综合征:40.0%;硬皮病:44.0%;RA: