病毒性疫苗new

1病毒类疫苗生产与质量控制要求中国食品药品检定研究院生物制品检定所NationalInstitutesforFoodandDrugControl胡忠玉2012.7.18.上海病毒类疫苗以病毒或病毒某种抗原成分为原料，可分为：►减毒活疫苗：麻疹、风疹、腮腺炎等减毒活疫苗：麻疹、风疹、腮腺炎等遗传重配疫苗：流感减毒活疫苗、小儿轮状减毒活疫苗►灭活疫苗：全病毒颗粒疫苗亚单位疫苗重疫苗指基程技术使克隆并表达保护性抗基表达的抗NationalInstitutesforFoodandDrugControl►重组疫苗：是指基因工程技术使用克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体本身制成的疫苗，主要包括亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等，如重组乙型肝炎疫苗、重组戊型肝炎疫苗新型疫苗：合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗、微胶囊疫苗等2病毒性疫苗工艺流程简述三级种子库澄清过滤（提减毒活疫苗三级细胞库种子减毒种子病毒种子重组体三级种子库接种细胞培养病毒收获（细胞收获）澄清、过滤（提取）、配制减毒活疫苗灭活、纯化、配制灭活疫苗三级细胞库NationalInstitutesforFoodandDrugControl纯化（灭活）配制重组疫苗原代细胞传代细胞人二倍体细胞内容1.灭活疫苗2.减毒活疫苗3.重组疫苗NationalInstitutesforFoodandDrugControl3灭活疫苗的优点1、所用生产毒种不必需要减毒或弱毒株；2、必须使用灭活剂灭活病毒；因此，可以灭活可能的外源因子；病毒性灭活疫苗优缺点3、严格的灭活试验验证病毒是否灭活；4、使用者较安全，无活疫苗毒性回复的潜在危险；5、存储和运输相对容易；灭活疫苗的缺点1、在灭活过程中可能破坏或改变有效的抗原决定簇，影响免疫效果；2生产时的纯化步骤多较复杂NationalInstitutesforFoodandDrugControl2、生产时的纯化步骤多，较复杂；3、免疫程序较繁复、需多次接种和加强；4、产生免疫效果时间短，不易产生局部免疫；5、抗原量要求大，成本较高；6、某些疾病灭活疫苗不但无效反而有害。灭活疫苗的关键点：病毒性灭活疫苗关键点1、生产用病毒种子2、生产用基质细胞或动物3、生产工序和/或步骤4、灭活剂和灭活方法5、纯化方法和纯度要求NationalInstitutesforFoodandDrugControl6、疫苗的添加剂7、单次收获液、原液、半成品和成品的质量和检定8、生产设施和厂房4原始种子主种子病毒种子批系统原始种子和主种子要求冻干保存于－20℃；工作种子可以液体保存于－60℃以下，一般不超过2年；病毒性灭活疫苗关键点1(病毒种子)来源、历史清楚鉴别试验验证确定为该病毒病毒增殖滴度达到要求工作种子下，般不超过年；建立的台帐实物一致各种子批标签：1、病毒名称2、代次3、数量4、批号5、制备日期6、病毒滴度NationalInstitutesforFoodandDrugControl免疫原性达到要求从原始种子主种子工作种子的传递不超过规定无细菌、真菌和支原体污染无外源因子污染新建的毒株还需要对关键蛋白质的核苷酸序列提出要求细胞库原材料•不得使用神经系统来源的细胞；•细胞培养液：不得含有人血清；•胰蛋白酶检测：应证明无细菌、真菌、支原体或病毒污染，特别是检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如猪细小病毒等；•抗生素：不得使用青霉素或β-内酰胺类抗生素细胞制备的要求•生产人员应定期检查身体；•生产区内不得从事非生产用细胞或微生物的操作；•同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物；细胞库的建立及管理•三级库的建立•细胞活性：冻存前的活细胞应不低于90%，复苏后细胞存活率应不低于85%；•主细胞库和工作细胞库应分别存放；NationalInstitutesforFoodandDrugControl•生产用细胞与非生产用细胞严格分开存放；细胞库的检定•细胞鉴别•无菌、支原体检查•内外源病毒因子检查•致瘤性(致瘤性细胞、条件致瘤性传代细胞、活病毒产品的细胞系/株、新建细胞系/株)•必要时：细胞染色体核型5原代细胞地鼠肾细胞中国药典（2010年版三部）灭活疫苗的动物细胞应来自封闭式房所内饲养的动物，并须检测与使用动物相关的特殊病毒病毒性灭活疫苗关键点2-1生产用基质细胞原代动物细胞沙鼠肾细胞鸡胚细胞兔肾细胞牛肾细胞猴肾细胞关的特殊病毒WHO对地鼠外源病毒检测的要求pathogenicforhamsters淋巴瘤病毒乳突淋瘤病毒多瘤病毒属腺病毒逆转录病毒淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒呼肠孤病毒－3型小鼠肺炎病毒小鼠微小病毒NationalInstitutesforFoodandDrugControl仙台病毒汉滩病毒鼠脊髓灰质炎小鼠肝炎病毒基里姆大鼠SV-5ToolansH-a我国目前用原代细胞生产的疫苗：1乙型脑炎灭活疫苗地鼠病毒性灭活疫苗关键点2-2生产用基质细胞或动物1、乙型脑炎灭活疫苗地鼠2、乙型脑炎减毒活疫苗地鼠3、狂犬病疫苗地鼠4、森林脑炎疫苗地鼠5、肾综合征出血热疫苗地鼠、沙鼠6、麻疹减毒活疫苗鸡胚7、风疹减毒活疫苗兔8、腮腺炎减毒活疫苗鸡胚NationalInstitutesforFoodandDrugControl、腮腺炎减毒活疫苗鸡胚9、黄热病减毒活疫苗鸡胚10、脊灰疫苗猴11、轮状病毒疫苗牛肾12、流感疫苗鸡胚6原代细胞的要求•对动物脏器组织或胚胎来源的动物应有明确健康状况和洁净级别要求；•不能建立细胞库只能限于原始培养的细胞或传代少数几•不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内（≤5代）•原代细胞培养物的检查：►细胞培养原材料检查及细胞培养操作►细胞培养物的检查►细胞形态检查NationalInstitutesforFoodandDrugControl►细胞形态检查►特定病毒检查►对照细胞检查原代细胞：地鼠肾、沙鼠肾优点：来源容易，动物的繁殖快，4-5周出现性周期，怀孕期15-18天，哺乳期20天产后2436小时即可发情排卵年可产810胎生产用细胞天，产后24-36小时即可发情排卵，一年可产8-10胎。制备的细胞没有遗传物质的突变，比较安全，不必考虑疫苗中的残余DNA；病毒容易在这些细胞中适应。缺点：需要建设相应的动物房，污染环境；制备疫苗需要宰杀大量的动物动物容易污染细菌、病毒、寄生虫等外源物质。NationalInstitutesforFoodandDrugControl7连续传代细胞系的特殊要求•生产用细胞代次：最高代次须符合要求(或经批准)；•生产过程中的细胞检查：除另有规定外，在生产末期，取不接种病毒的细胞作为对照，至少进行细胞鉴别试验、支原体检查、对照细胞外源病毒因子检测，应符合要求。NationalInstitutesforFoodandDrugControl人二倍体细胞株的特殊要求•新建的人二倍体细胞株（资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明，以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面材料）•染色体检查：对新建遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BSMRC-5等在建立MCB时可•染色体检查：对新建、遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BS、MRC5等，在建立MCB时可不必检查•无菌、支原体检查：每8~12世代细胞培养物•病毒检查：传代过程中，至少对2个不同世代水平进行病毒包含体、HBV、HCV、EB、HIV等进行检查，应为阴性。•致瘤性检查：每8~12世代应做一次，应为阴性。•生产过程中的细胞检查：►染色体检查：通常对于含有活细胞的制品或下游纯化工艺不足的制品；对已建株的人二倍体细胞生产则不要求NationalInstitutesforFoodandDrugControl对已建株的人二倍体细胞生产则不要求；►细胞鉴别试验：每年应至少检查一次该项试验；►无菌、支原体检查►对照细胞外源病毒因子检测8二倍体细胞2BSMRC-5传代细胞Vero1、冻存于液氮2、一式两份保存病毒性灭活疫苗关键点2-3生产用基质细胞,传代细胞库CHO原始细胞库细胞库的建立主细胞库工作细胞库引进的细胞一般为主细胞和工作细胞库细胞鉴别试验式两份保存3、细胞库台帐与实物一致4、细胞管标签：细胞名称细胞批号细胞代次细胞数/ml管号NationalInstitutesforFoodandDrugControl细胞鉴别试验无菌检查支原体检查细胞内、外源病毒因子检查（外源因子，特别是逆转录病毒）致瘤性必要时：染色体核型检查管号制备日期二倍体细胞具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；病毒性灭活疫苗关键点2-4传代细胞库在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖；无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。常见的二倍体细胞：WI-38IMR-90MRC-52BSKMB-17二倍体细胞代次的计算：以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增NationalInstitutesforFoodandDrugControl加一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶（1：2分种率），再涨满瓶为一世代；一瓶细胞传四瓶(1：4)为二世代；一瓶细胞传八瓶(1：8)为三世代。9——取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产病毒性灭活疫苗关键点2-6传代细胞库经复苏、扩增后的细胞仅用于批疫苗的生产细胞传代次数：1234567810111200011248163264128256疫苗NationalInstitutesforFoodandDrugControl000248（8）16326412825600038（8）16326412825600048163264128256批号Vero细胞用于疫苗生产的优缺点优点：1传代细胞系几乎可以取之不竭病毒性灭活疫苗关键点2-5传代细胞库优点：1、传代细胞系，几乎可以取之不竭2、已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经建立，细胞质量可高度控制3、该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；4、可用生物反应器大规模生产5、大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖6、疫苗生产不要动物缺点1由于是传代细胞系有定的致肿瘤性疫苗必须纯化且细胞DNA含量NationalInstitutesforFoodandDrugControl缺点：1、由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准2、目前不适合活疫苗的生产10Vero细胞疫苗的研究V细胞的来源和历史生产用细胞Vero细胞的来源和历史日本Chiba大学的Yasumura于1963年3月取自非洲绿猴肾。建立该细胞系是为了研究SV-40与肿瘤的关系；Vero细胞的命名：取自世界语的二个字合并而成VERE绿色的意思；RENO肾脏的意思VERE但世界语中无此字型，Yasumura将其改为VERO且VERO在世界语中有真理之意，从而该细胞系定名为VERO。NationalInstitutesforFoodandDrugControlChiba大学的Simizu博士将该细胞传至93代于1964年6月后送美国国立卫生研究所的热带病毒实验室。热带病毒实验室传至113代交ATCC收藏。Vero细胞的致肿瘤性Montagnon实验：用裸鼠进行肿瘤实验，106或107细胞注射裸鼠，同时用Hl细胞作对照生产用细胞同时用Hela细胞作对照137-169代：注射部位结节呈退行性变，全部动物无肿瘤发生190-210代：注射部位结节呈进行性变，全部动物出现肿瘤，且半数动物发生肺和淋巴节的肿瘤转移。结论代以前的细胞是安全的NationalInstitutesforFoodandDrugControl结论：170代以前的细胞是安全的11Vero细胞残余DNA的致瘤性质量标准：80年代美国FDA→10pg/剂生产用细胞欧盟、WHO→100pg/剂我国卫生部→100pg/剂90年代后期WHO推荐为→10ng/剂2000年版《中国生物制品规程》→10ng/剂