Western-blot-技术-详细版

Westernblot实验技术定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。快速、特异，信号弱、昂贵信号强、二抗选择多，非特异性结合WesternBlot一般流程SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备裂解液只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA,SDS)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶浓度与蛋白分离范围安装玻璃板对齐、加紧配胶混匀、不要过度，防止氧化转膜NC膜PVDF膜结合能力80-110ug/cm2125-200ug/cm2材料质地脆韧性好溶剂耐受性无有操作程序缓冲液润湿100%甲醇润湿价格便宜较贵大于20KD—0.45um小于20KD—0.2um小于7KD—0.1um转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。（小分子量蛋白）湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。（大分子量蛋白）不能有气泡不要污染膜的表面注意正负极冰浴冷却湿转半干转不能有气泡滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热封闭脱脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4℃过夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37℃一小时，4℃过夜。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。二抗与底物反应显色•辣根过氧化物酶法（HRP）•碱性磷酸酶法（AP）•化学发光显色法(HRP)DAB显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不能重新剥离检测ECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测WesternBlot常见问题分析SDS-PAGE电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温背景太高1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高原因对策1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度没有阳性条带或比较弱1.抗体染色不充分2.靶蛋白含量太低3.HRP抑制剂4.转膜时间不够5.曝光时间过短原因对策1.增加抗体滴度，延长孵育时间2.增加样本上样量3.所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠4.大分量蛋白相应增加转膜时间及曝光时间弥散性条带或非特异性条带1.抗体浓度太高2.蛋白上样量太多3.交叉反应原因对策1.降低抗体浓度2.降低样本上样量