课件1-基因检测新进展

基因检测新进展郑州大学第一附属医院河南省卫生厅临床检验中心明亮1目录基因检测的技术方法基因检测的应用进展23基因与基因检测12第1部分基因与基因检测3什么是基因？基因是编码RNA和蛋白质的核苷酸序列；大部分生物中构成基因的核酸物质是DNA，少数生物（如RNA病毒）中是RNA。地球上人与人之间基因序列的差异仅仅为万分之一，其中99.99%序列是相同的。4DNA的分子结构磷酸脱氧核糖碱基5格里菲斯证明遗传物质是核酸1928年1929年1952年1953年1970年科赛尔和琼斯以及列文发现核酸由核苷酸组成，核苷酸由碱基、核糖和磷酸构成。赫尔希证明DNA具有遗传功能沃森和克里克提出DNA的双螺旋结构和自我复制机制克里克提出完整的中心法则模式基因的发现历程1961年马太和尼伦伯格破解出Phe的密码子（UUU）6什么是基因检测？基因检测是通过血液、体液或细胞对DNA分子信息作检测，预知身体患疾病的风险，分析基因情况。基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。7基因检测的发展历史1990s2000s2010s1994年，美国率先在一些人群中开展肠癌基因筛检1990年，人类基因组计划正式启动2002年，欧盟有超过70万人进行了基因检测实验2004年，世界卫生组织推出基因检测国际标准2015年，奥巴马人类基因组计划所取得的成果，并宣布了新的项目精准医疗8基因检测风靡全球9第2部分基因检测的技术方法10基因检测的技术方法基因异常的形式有很多种，所适用的检测方法也有很多种不同的检测方法相互弥补，难以完全替代根据检查目的，选择合适的检测方法很重要11基因检测的技术方法杂交扩增测序Southern杂交Northern杂交荧光原位杂交基因芯片…………一代测序（Sanger测序法）二代测序（NGS）三代测序（NNGS）……………………逆转录PCR反向PCR巢式PCR原位PCR多重等位基因PCR不对称PCR锚定PCR长片段PCR荧光定量PCR122.1荧光原位杂交（FISH）FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。广泛应用于基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。BCRABLBCR/ABL13实时荧光定量PCR检测技术(外标法）普通PCR检测技术高敏感度内标荧光定量PCR检测技术（内标法）2.2聚合酶链式反应（PCR）14PCR的基本反应步骤模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸经历25-30个循环目的DNA增加106~7第二个循环以DNA一条链为模板聚合酶引物以半保留复制原则合成新的DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理152.3基因测序162.3.1一代测序（Sanger测序，双脱氧链终止法）Sanger法的原理是：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。17第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GSFLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。2.3.2二代测序next—generationsequencing18❖单分子即时DNA测序技术(SMRT)❖HeliScope单分子测序❖基于荧光共振能量转移的即时DNA测序❖纳米孔单分子测序技术2.3.3三代测序单分子测序技术➢速度更快➢片段更长➢精度更高➢可直接测RNA序列。➢可直接测甲基化的DNA序列。19一至三代测序技术比较20第3部分基因检测的应用进展213.1肿瘤靶向治疗22靶向治疗的进展基因检测方案1方案2方案323肿瘤靶向药物（部分）疾病相关靶标基因相关基因位点药物名称指导意义非小细胞肺癌EGFR基因突变18、19、20、21外显子吉非替尼（易瑞沙）埃罗替尼（特罗凯）1、野生型疗效差2、突变型疗效显著增加3、Exon20中790密码子发生突变，可能出现继发性耐药KRAS基因突变12、13、61密码子1、野生型疗效较好2、突变型疗效显著降低结肠直肠癌KRAS基因突变12、13、61密码子西妥昔单抗（爱必妥）帕尼单抗（维克替尼）1、野生型疗效较好2、突变型疗效显著降低BRAF基因突变466、600、616密码子1、野生型疗效较好2、突变型疗效显著降低PIK3CA基因突变19、20外显子1、野生型疗效较好2、突变型疗效显著降低慢性髓性白血病CKIT基因突变9、11、13、17外显子伊马替尼（格列卫）1、野生型疗效差2、突变型疗效显著增加3、Exon11突变有效率最高PDGFRA基因突变12、18外显子1、野生型疗效差2、突变型疗效显著增加3、Exon18中D842V突变可能出现原发性耐药24疾病相关靶标基因相关基因位点药物名称指导意义肾细胞癌PDGFRmRNA表达PDGFR索拉菲尼舒尼替尼高表达患者能明显提高生存率VEGFR1/2mRNA表达VEGFR1/2高表达患者能明显提高生存率结直肠癌VEGFmRNA表达VEGF贝伐单抗高表达患者能明显提高生存率VEGFR1/2mRNA表达VEGFR1/2高表达患者能明显提高生存率乳腺癌HER2基因扩增Her2曲妥珠单抗（赫赛汀）拉帕替尼HER2基因高表达疗效好，低表达疗效差PI3KCA基因突变9、20外显子PIK3CA基因野生型患者疗效较好；PIK3CA基因突变性患者，疗效显著降低非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因EML4-ALK克唑替尼ALK基因表达患者疗效较好慢性粒细胞白血病ABL突变315密码子格列卫慢性粒细胞白血病患者中，ABL基因野生型患者疗效较好；T315I突变型患者，疗效显著降低253.2精准医疗计划2015年奥巴马提出精准医疗计划：精准医学赋予了我们一个实现全新医学突破的伟大机会，拯救生命的发现将迎来新时代，而这一项目将为此奠定基础。-------精准医疗离不开精准检测26《我的医疗选择》——安吉丽娜·朱莉致纽约时报时间：2013年5月14日内容：我是BRCA1基因携带者，这种基因存在着缺陷，会导致罹患乳腺癌和卵巢癌的风险大幅提高。……做出接受乳房切除手术这一决定并非易事。然而，我很高兴自己做出了这样的决定。现在，我的乳腺癌发病率已经从87%降至5%以下……朱莉效应27精准医疗概念精准医疗是应用现代遗传技术，分子影像技术，生物信息技术结合患者生活环境和临床数据实现精准的治疗与诊断，制定具有个性化的疾病预防和治疗方案。是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式中国工程院院士詹启敏28精准医疗的作用123提高治疗的有效性降低药物的副作用节约医疗的费用29精准医学贯穿整个疾病预防和诊疗过程预防诊断治疗确定风险人群，实现精准预防实现疾病的早期诊断和精确分类优化治疗策略，提高疗效、降低副作用提高健康水平30传统治疗模式：“反复探索”医学观察诊断治疗安全/毒性有效/无效调整用药观察诊断治疗基因检测安全有效精准医疗模式：“量体裁衣”医学精准医疗模式313.3基因检测临床应用实例•HPV基因分型•遗传性耳聋基因检测•药物代谢基因检测32原理：核酸分子杂交是指两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链或一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程。3.3.1HPV基因分型33HPV基因分型与相关疾病扁平疣3、10、27、28、41寻常疣1、2、4、7、27、29、40、54疣状表皮发育不良5、8、12、14、15、17、19、2538、46、47、49、50尖锐湿疣6、11、16、18、31、33、34、35、39、51、64-68、70、73鲍温样丘疹病16、18、39、42宫颈上皮内瘤6、11、16、18、31、33、35、43、44、51、56、58、61浸润性宫颈癌16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68阴茎癌16、18女阴癌16、1834耳聋非综合征型（70%）遗传因素（约60%）常染色体隐性（80%）环境因素（约20%）综合征型（30%）Alport综合征Pendred综合征Waardenburg综合征BOR综合征Usher综合征……等细菌感染病毒感染耳毒性药物外伤磕碰声损伤……常染色体显性（15%-20%）性连锁（1%）线粒体（1%）不明原因（约20%）很可能是遗传因素JournalofAudiologyandSpeechPathology.2011,19(1):73-77遗传是耳聋最大病因3.3.2遗传性耳聋基因检测35第一大耳聋基因GJB2临床表现先天性耳聋遗传方式携带比率常染色体隐性遗传聋人中的21%正常人群的2%~3%36“一巴掌致聋基因”SLC26A437临床表现迟发性耳聋大前庭水管综合征遗传方式携带比率常染色体隐性遗传14.5%的聋人约2%正常人群携带“一针致聋”基因12SrRNA临床表现药物敏感性耳聋遗传方式携带比率线粒体基因母系遗传4.4%的聋人0.3%正常人群38后天高频听力损失GJB3：我国克隆的第一个遗传病基因后天高频聋基因GJB3需要进行听力补偿393.3.3药物代谢基因检测•药物代谢受药物代谢酶调控，药物代谢酶受基因调控。•根据药物代谢基因的突变情况分为快代谢、中间代谢和慢代谢型。•医师可以根据代谢类型确定用药剂量，从而提高疗效和减少不良反应。40•细胞色素P450(cytochromeP450)家族的一员，P450是肝脏药物代谢的主要酶系。由P450酶负责代谢的药物中，12%由CYP2C19代谢。•CYP2C19具有多种等位基因，CYP2C19﹡1（681G，636G）为野生型。最常见的突变是CYP2C19﹡2和CYP2C19﹡3。•检测﹡2、﹡3两个位点，可覆盖99%以上中国突变人群。CYP2C19突变位点效应亚洲人发生频率*1无突变野生型65%*2681G-A突变型23-30%*3636G-A突变型5-13%氯吡格雷（波立维）是目前世界范围内使用最广泛的抗血小板药，可以减少心血管疾病患者心脏病发作、卒中以及死亡的风险。氯吡格雷是一种前体药物，在体外无活性，必须经CYP2C19代谢活化才能抑制血小板的聚集。氯吡格雷由CYP2C19代谢的临床代表性药物42CYP2C19基因检测指导氯吡格雷个体化用药快代谢者中等代谢者弱代谢者CYP2C19*1/*1CYP2C19*1/*2*1/*3CYP2C19*2/*2*2/*3*3/*3基因检测分型增加用药量或者换药常规用药增加用药量或者换药PS：美国FDA强烈建议患者服用氯吡格雷前需检测CYP2C19基因型433.4基因检测的未来趋势44基因检测的未来趋势我国基因检测的人群在5%左右，每年基因检测量至少在300万人次以上，并且逐年递增，市场空间极其巨大，发展前景十分可观•通过基因检测，人们可以了解自己的“内因”风险，做到有目的、有针对性的预防。•通过基因检测，辩证用药、因人而异，给病人找到最合适的药物，不仅降低了不必要的医疗支出，提高疗效，更避免对人体造成不必要的伤害。基因技术的发展必将给人类的生活和生命带来革命性的变革，基因研究将为新医药、新疗法、新保健、新预防提供持续性发展的保证。惊人而庞大的市场需求对于疾病预测和指导正确用药具有重要作用基因检测将成为未来发展的主流45精准医疗造福人类个性化治疗方案临床信息、疾病队列、生物样本库大数据组学分析精准治疗增加疗效、降低副作用、降低费用分子影像分子