流式细胞术在哺乳动物精液质量检测中的应用

流式细胞术在哺乳动物精液质量检测中的应用采克俊1,2，司维1,2，李亚辉1,2,3，季维智1,4（1.中国科学院昆明动物研究所，云南昆明650223;2.中国科学院研究生院，北京100039；3.云南农业大学食品科学与技术学院，云南昆明650201）摘要：精液检测的首要目标就是快速准确地确定其生育力。同时具备多种特性功能完整的精子才能受精，因而只有同时客观地检测多个指标，才能更好地反映精子的生育力。精子检测的传统方法费时费力，检测精子数量少，指标单一，而且易受操作者的主观影响，不能准确地反映精子功能。流式细胞术(FCM)为精子功能研究提供了一种快速、客观、多指标、大通量的检测手段；利用FCM检测精子的质膜完整性、顶体状态、染色质结构、线粒体功能以及细胞凋亡等，可以得知精子的相关功能情况。随着新的荧光探针、染色方法的不断开发和改进，FCM为精液质量检测提供了一种新的检测平台，应用前景极其广阔。关键词：流式细胞术；精子；检测；荧光探针EvaluationofMammalianSemenQualitybyFlowCytometryCAIKe-jun1,2,SIWei1,2,LIYA-hui1,2,3,JIWei-zhi1,4(1.KunmingInstituteofZoology,theChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;2.GraduateSchool,theChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China3.CollegeofFoodScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)Abstract:Theprimarygoalofallsemenanalysesistoaccuratelydeterminethefertilizingpotentialofasemensamplerapidly.Sinceaspermatozoonmustpossessmanyattributesinordertofertilizeanoocyte,theonlywaythatwecanmorepreciselypredictthefertilityistodevelopunbiasedassaysthatmeasureseveralspermtraitssimultaneously.Conventionallaboratoryassaysofspermatozoa,usingsubjectivemethod,manyaretimeconsuming,andarenecessarilyconductedonsamplesofrelativelysmallsize,fallshortofpredictingthespermfunction.Flowcytometry(FCM)permitsustoobjectivelymeasurethousandsofspermformultiplecharacteristicsinashorttimewithminimumpreparation.TheapplicationsofFCMtoevaluationofsemenqualityincludingspermmembraneintegrity,acrosomestatus,chromatinstructure,mitochondrialfunctionaswellasapoptosisetc,provideusvaluableinformationregardingspermfunction.Newfluorescentprobesandtechniquesarecontinuouslybeingdeveloped.FCMofferspowerfultoolsand基金项目：国家自然科学基金（39970117）；中国科学院重大项目（KZ952-J1-109）4通讯作者（Correspondingauthor）,Tel:[phone],E-mail:[e-mail],ac.cnexcitingopportunitiesforimprovingourabilitytoaccuratelyevaluatesemenquality.Keywords:Flowcytometry;Spermatozoa;Evaluation;Fluorescentprobes精液质量检测在临床治疗不孕症及家畜良种繁殖和育种中具有重要作用。常规的精液检查（精子密度、活力、形态等）重复性差，提供的精子功能的信息非常有限，不能为生育力提供准确评估的依据。其他方法（包括精子染色的显微镜检测、精子-颈粘液相互作用检查、精子穿透去透明带仓鼠卵实验、低渗肿胀实验以及超微结构检查等）虽然可以提供精子功能方面的一些信息，但费时费力；检测精子数量少；指标单一；且易受操作者的主观影响，不能准确反映精子的功能。近年来，随着生殖生物学的发展和人类对辅助生殖技术的迫切需求，基于精子形态学观察为主的传统检测方法已不能满足人们的需要，因而寻找一种快速、准确的精液质量检测方法显得十分迫切。流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一种单细胞快速分析技术，已广泛应用于细胞生物学和医学的各个领域。流式细胞术的基本原理是：特异荧光探针标记的单细胞悬液在管道中稳定地流动，细胞一个个依次经过喷嘴，经恒定功率的激光束激发后产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向的光电二极管和侧向的光电倍增管接收，经计算机处理，细胞的一系列特性就被快速准确地测定。在此基础上还可以根据有关参数把所需细胞亚群从整个样品中分选出来。FCM在哺乳动物精子研究中发挥着重要作用：通过分析生精细胞增殖周期研究精子的发生过程；还可根据X、Y精子DNA含量的差异进行精子性别鉴定，即精子分选；检测精液质量。流式细胞仪为精子功能实验提供了快速、客观、多指标、大通量的检测手段，弥补了传统方法的缺陷，成为一种检测精液质量的新平台。随着新的荧光探针和染色方法的不断开发和改进，这一新的检测技术在近20年来应用越来越广泛，也必将在人类辅助生殖技术、畜牧业冻精商业化运作以及珍稀濒危物种的精子冻存研究中展现更加广阔的应用前景。本文就流式细胞仪近年来在检测精子的质膜完整性、顶体状态、染色质结构完整性、线粒体功能、细胞凋亡等方面的应用作一简要综述，并对其应用前景作一展望。1测定精子的质膜完整性精子的质膜完整性又可称为精子的活力（viability），是检测精液质量的重要指标之一，也是FCM应用最多的领域。对死精子特异的荧光染料有碘化丙锭(propidiumiodide，PI)、Hoechst33258、溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)、溴乙啡锭二聚体（ethidiumhomodimer-1,EthD-1）和Yo-Pro-1等，其中PI最为常用。它们是膜不透性的DNA探针，只有质膜破损的精子，染料才能进入细胞与DNA结合。对活精子特异的荧光染料有SYBR-14、羧基荧光素双醋酸盐(carboxyfluoresceindiacetate,CFDA)、羧基二甲基荧光素双醋酸盐（carboxydimethylfluoresceindiacetate,CMFDA）、Carboxy-SNARF-1和SYTO-17等。它们是膜通透性的染料，能进入细胞膜完整的精子。其中，Carboxy-SNARF-1是一种胞内pH指示剂，在活精子内发橙红色荧光(Penaetal，1999)；SYTO-17标记活精子的细胞核，发红色荧光(Thomasetal,1997)；CFDA和CMFDA是一种非荧光化合物，在活细胞胞内被非特异酯酶水解，形成一种很强的荧光染料，发绿色荧光(Penaetal,1998;Ericssonetal,1989)。这两类染料经常联合使用。对死精子特异的荧光染料虽然可以单独使用，但效果不如联用好。SYBR-14和PI联合使用，可以很好地检测精子活力（Garneretal，1994；Garner&Johnson，1995）。其原理可能是PI进入死精子头部后端，取代了SYBR-14或使SYBR-14的荧光猝灭。样品经流式细胞仪检测可得3种亚群：①被SYBR-14染成绿色的活精子，并且比死精子亮得多；②被PI染成红色的死精子；③同时染上并发出两种荧光的双阳性精子，正处于从活向死的过渡状态。这种方法已用于检测许多物种的精子活力。CFDA、CMFDA、SYTO-17等分别与PI联合染色，通过流式细胞仪检测也可得到类似的3类精子。Carboxy-SNARF-1也可以和PI联合使用，Carboxy-SNARF-1发橙红色荧光,但其荧光值大大低于PI的荧光值，用同一个探测器也能把两者区别开(Penaetal,1999)。这一组合的优点是可以和发绿色荧光的顶体探针结合。否则只用PI测活力，活精子和颗粒较大的杂质（如蛋黄颗粒）都不能被PI标记，也就不能把两者区分开。Hoechst33342是一种膜通透性活体染料，死精子和活精子都标记，而PI只标记死精子。本研究室发展了一种仅用紫外激光就同时激发这两种探针来检测精子活力的方法：活精子只被Hoechst33342标记，发蓝色荧光；死精子为PI阳性，同时也被Hoechst33342标记，故死精子为粉红色。这一染色方法适用于流式和荧光显微镜检测，且可以和发绿色或黄色荧光的其他探针合用，同时检测多个指标。该方法已成功地用于牛、猕猴、食蟹猴、人、大鼠、小鼠精子活力的检测（资料待发表）。一般认为，在精子活力检测的所有方法中，SYBR-14与PI的联合使用效果最佳。该组合染色时间短，对温度要求不严格，且都是核染料。而其他组合染色时间长，标记的细胞器不同，易出现误差。2检测顶体状态在受精过程中，哺乳动物刚射出的精子在体内要经过获能和顶体反应，才能穿入卵细胞并与其融合，完成受精。因此检测精子的顶体状态，有助于反映精子的受精能力。金霉素(chlortetracycline,CTC)顶体染色法,是荧光显微镜检测的常用方法，可客观而定量地评价精子获能、顶体反应(DasGuptaetal,1993)。但这种染料在FCM检测时不能很好地将获能与未获能的精子分开，而且样品要固定，所以CTC染色法不适用于FCM（Rathietal,2001）。精子在获能和顶体反应过程中，精子膜外源凝集素受体会发生变化。因此可以利用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的凝集素检测精子的顶体状态。已经有多种凝集素被用于精子顶体状态检测，如花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、刀豆凝集素（ConA）和植物血凝素（RCA）等。其中PNA和PSA较常用，PNA效果最好。经电子显微镜观察证实，PNA特异结合顶体外膜（Szaszetal,2000）。FITC-PNA检测顶体反应有两种样品处理方法：①样品需要固定，FITC-PNA才能穿过质膜和顶体外膜，标记顶体。顶体完整的精子可结合更多的FITC-PNA，故FITC-PNA荧光值变得更高；而顶体反应后，顶体丢失，FITC-PNA的荧光值又较低(Purvisetal,1990)。死亡降解的精子也会出现顶体丢失，但只有活精子的顶体丢失才能称为真正的顶体反应。因而检测顶体反应必须同时检测精子的活力。Taoetal（1993a）先用Hoechst33258标记，之后加入一定量鲑鱼精子DNA（SS-DNA）结合多余的染料，洗涤后再固定，再用FITC-PNA标记，Hoechst33258阴性、PNA阳性者为顶体反应的精子。尽管这种方法可以同时测得精子活力和顶体状态，但该方法较烦琐。②不经固定，直接用精子活力染料PI（或Hoechst33258、EthD-1）和FITC-PNA标记。其结果PI+为死精子；PI－/PNA+为顶体反应精子；PI－/PNA－为顶体完整的活精子(Grahametal,1990；Szaszetal