细胞因子

人民卫生出版社第三章细胞因子人民卫生出版社•细胞因子（cytokine,CK）是由免疫细胞或非免疫细胞合成、分泌的一类小分子多肽或糖蛋白，是一类重要的生物应答调节剂。•具有调节细胞的生理功能、参与免疫应答及介导炎症反应等多种生物学效应。•临床上已应用重组技术制备某些细胞因子，用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、免疫缺陷疾病等。人民卫生出版社第一节细胞因子的特性一、理化特性众多细胞因子均为小分子（8～30kD）分泌型糖蛋白。二、分泌特性细胞因子通常以自分泌或旁分泌形式作用于产生细胞因子的本身细胞或邻近细胞。人民卫生出版社人民卫生出版社三、产生特性（一）细胞因子的产生具有多源性（二）细胞因子的产生具有多向性接受某种抗原或有丝分裂原刺激后，一种细胞可分泌多种细胞因子，几种不同类型的细胞也可生成一种或几种相同的细胞因子人民卫生出版社人民卫生出版社四、作用特性（一）非特异性（二）多效性（三）重叠性（四）高效性（五）拮抗性（六）协同性人民卫生出版社第二节细胞因子的类型一、根据细胞因子的来源分类由单个核细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine，MK)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子(lymphokine，LK)。二、依据细胞因子的生物学功能分类可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化因子等六大类。人民卫生出版社（一）白细胞介素（interleukin,IL）（二）肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)生物学效应：1.抗肿瘤作用2.免疫调节作用3.抗病毒作用4.促炎症因子5.致热作用6.恶病质人民卫生出版社(三)干扰素（interferon,IFN）由病毒或干扰素诱生剂刺激机体细胞产生的一种具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功能的小分子多肽。•I型IFN-αIFN-β抗病毒、抗肿瘤•II型IFN-r免疫调节(四)集落刺激因子（colony-stimulatingfactor，CSF）(五)趋化因子(六)生长因子（growthfactor，GF）人民卫生出版社各类细胞因子在造血过程中的作用人民卫生出版社第三节细胞因子的生物学功能一、参与和调节免疫应答二、介导炎症反应三、抗感染和抗肿瘤作用四、刺激造血功能五、诱导细胞凋亡人民卫生出版社细胞因子对Th1和Th2细胞分化的调节作用免疫调节作用人民卫生出版社各种细胞因子在造血过程中的主要作用刺激造血功能人民卫生出版社第四节细胞因子的医学意义一、细胞因子与疾病的发生（一）引起发热及内毒素休克（二）与某些肿瘤的形成有关（三）与某些免疫相关性疾病的发生有关二、细胞因子与疾病的诊断三、细胞因子与疾病的治疗人民卫生出版社第五节细胞因子相关检验技术细胞因子在免疫应答的调节和效应环节中起重要作用，其在体内水平的高低可直接反映机体的免疫状况，因而细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，在临床上具有实用价值。人民卫生出版社一、细胞因子的生物学检测法（一）细胞增殖测定法以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激依赖性细胞株的增殖，来评估细胞因子的活性水平。检测细胞增殖的常用方法有3H-TdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。人民卫生出版社通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染放射性核素掺入法人民卫生出版社待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）按不同稀释度加入37ºC，16h~20h加入3H-TdR（1Ci~5Ci）37ºC，4h~6h收集细胞测定白细胞介素-2的测定示意图人民卫生出版社（二）细胞毒活性测定对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用一系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测细胞因子活性的定量测定。本法常用于TNF等的测定人民卫生出版社肿瘤坏死因子的测定示意图待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37ºC，24小时弃取上清，洗涤加入结晶紫染液，洗涤加入细胞裂解液，比色人民卫生出版社（三）抗病毒活性测定法本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染从而抑制细胞病变。人民卫生出版社Wish、Hep2/c人干扰素L929小鼠干扰素Ratec大鼠干扰素A549MDBK多种族的IFN-α和IFN-γ本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（CPE）。VSV、EMCV及Sindbisvirus等细胞病变效应（CPE）抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒检测抗病毒活性的方法人民卫生出版社待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37ºC，4h37ºC，24h~48h弃取上清，加入VSV观察细胞病变（镜检或比色）干扰素的测定示意图人民卫生出版社（四）趋化活性测定法多种细胞因子具有趋化活性，能分别诱导中性粒细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞等定向迁移。人民卫生出版社趋化性(chemotaxis)：诱导细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处作定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。化学增活性(chemokinesis)：细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导细胞移动的方式趋化活性测定法滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意敏感性较高特异性不高操作烦琐易受干扰生物学活性测定方法学评价人民卫生出版社二、细胞因子的免疫学检测法利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量分析细胞因子。（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）是定量分析中最常用方法。但不能判断细胞因子的生物学活性。人民卫生出版社ELISA方法ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定人民卫生出版社敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。ELISA特异、简便易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法人民卫生出版社(二)酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关基本原理ELISPOT人民卫生出版社（三）流式细胞分析法流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。1．分离和培养待检细胞2．细胞固定3．封闭非特异性结合位点4．染色与分析基本步骤细胞内细胞因子检测技术激活膜抗原标记细胞内细胞因子标记人民卫生出版社使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1细胞IFN-γTh2细胞IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术直接或间接荧光抗体染色无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态人民卫生出版社免疫学测定方法学评价优点：特异性高操作简便、快速，无需依赖细胞株影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点：所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系敏感性相对较低标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合人民卫生出版社三、细胞因子的分子生物学检测法利用分子生物学技术，制备出细胞因子的基因探针，通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子基因的表达，这是一种高度敏感和高度特异的检测技术，目前在实验室研究中使用较广，其缺点是操作较为烦琐，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。人民卫生出版社（一）Northern印迹杂交法Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。从细胞中提取RNA，经甲醛、琼脂糖凝胶变性电泳，分离单链RNA，并将RNA转印到硝酸纤维素膜上，再与特异序列DNA探针进行杂交。人民卫生出版社（二）斑点杂交法（dotbloting）本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。该法先将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样，也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。人民卫生出版社（三）PCR与逆转录PCRPCR即聚合酶链式反应。聚合酶链式反应这种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。RT-PCR即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的PCR相结合的技术。人民卫生出版社（四）原位杂交和原位PCRRNA-DNA原位杂交是在细胞内mRNA原有位置上进行杂交，细胞则尽可能保持原有形态。原位PCR是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。