5-感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株

Q&A•关于酶切/连接的结果预期结果PV0V1V1’M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp酶切产物的琼脂糖电泳（1%）P:双酶切的PCR产物;V0：未酶切的质粒;V1：酶切不完全的质粒;V1’:完全酶切的质粒;M:分子量标准（DL2000)我们的结果12345678910酶切产物的琼脂糖电泳（1%）Lane1～4：双酶切的PCR产物Lane6～9：双酶切的质粒lane5：未酶切的质粒Lane10:分子量标准（DL2000)1234567ABCDEFGHM酶切产物的琼脂糖电泳（1%）Lane1～7：双酶切的PCR产物LaneB～H：双酶切的质粒laneA：未酶切的质粒LaneM:分子量标准（DL2000)真不错我们的结果4组5组的PCR酶切DL15000分子量分布（bp）：15000，10000，7500，5000，2500，1000，2506组3组我们的结果5组的质粒酶切7组的质粒酶切酶切没有切开？还是电泳行为异常？需要鉴定。Q&A•关于酶切产物的回收胶回收：更纯，相对回收率低；液体直接回收：相对回收率高。•酶的量：酶的星号活力；感受态细胞的制备连接产物转化克隆菌株基因的克隆与表达专题之四&pETBlueSystem：蓝白筛选：其具有的大肠杆菌tet启动子是弱的组成型启动子，驱动下游LacZα-片段表达实现蓝白筛选；高效可诱导表达：高效表达外源蛋白。pETblue系统可选用NovaBlue(λCE6,在λPL启动子的驱动下表达T7RNA聚合酶的噬菌体)或TunerTM(DE3)pLacI菌株做宿主菌。这些宿主的基因组上带有lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因，可以实现IPTG诱导。低本底表达：由于T7-lac启动子驱动的外源基因的表达方向与tet启动子驱动的LacZα-片段表达的方向相反，所以此系统基本没有外源基因的本底表达。InductiveExpression--Introduction大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、昆虫、酵母、植物实验中，要根据所要表达的蛋白质的大小、蛋白质的需要量、是否需要活性以及实验室的条件等综合考虑选择合适的宿主-载体系统大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养，费用低，已有许多成功的先例，是首选的表达系统，但大肠杆菌中缺少翻译后修饰系统，一些修饰后才有活性的蛋白必需选择真核细胞为宿主分离基因构建重组载体转化筛选鉴定表达与优化表达条件InductiveExpression--Introduction表达宿主系统TunerTM菌株是BL21的lacZY缺失突变株，能够同时调整同一培养体系中所有细胞的蛋白表达水平。lac通透酶（lacY）突变使得IPTG均匀进入群体所有细胞，从而获得浓度依赖的、水平均一的诱导。通过改变IPTG浓度，表达可从极低水平调节到极强的、完全诱导的表达水平（通常与所使用的pET载体相关）。低水平表达可以增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner（DE3）pLacI菌株可与pETBlue和pTriExTM载体的配合使用。NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力（与相应的质粒配合使用）和促进质粒DNA高产的recAendA突变。由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点.（DE3）宿主菌是lDE3溶原菌，染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因。这类菌株配合pET载体一起表达。pLysS是带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。pLysS菌株在被诱导前T7RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白。InductiveExpression--IntroductionLacIpETBlue大肠杆菌基因组Lac启动子T7启动子IPTG诱导IPTG诱导大肠杆菌RNA聚合酶T7RNA聚合酶基因1T7RNA聚合酶T7RNA聚合酶靶基因pETBlue系统调控元件LacILac阻遏物Lac阻遏物DE3LacOLacOpLacITunerTMDE3LacIInductiveExpression--IntroductionX-gal：5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D半乳糖苷X-gal（无色）深蓝色β-半乳糖苷酶Α互补：ω片段（无活性，宿主）+α片段（无活性，载体）β-半乳糖苷酶（活性）无菌冰浴轻柔制备感受态细胞预培养:(昨天下午)LB培养基（4mL，含12.5μg/mLTet）37℃、190rpm振荡培养过夜扩大培养:(今天早晨)0.4mL预培养菌液＋40mLLB液体培养基（含12.5μg/mLTet）37℃、250rpm振荡培养2.5-3小时NovaBlue收集细胞：终止培养（OD6000.4-0.5）转移菌液到50mL离心管中，冰浴10min离心（4℃，4000rpm×10min）！！！弃液:倒出培养液，将管倒置使培养液流尽制备感受态：穿孔：加入预冷的CaCl2（0.1mol/L，10mL）轻柔吹悬菌体细胞（用5mL枪头）冰浴30min收集：离心(4℃，4000rpm×5min)，充分弃上清保存：预冷的CaCl2（0.1mol/L，2mL）冰上轻柔吹悬菌体细胞分装保存：200uL/份（-20℃短期或-70℃稍长期冻存）感受态连接产物转化克隆菌株1、样品制备用枪头轻柔混匀，冰上放置30min实验管阳性对照阴性对照1阴性对照2感受态细胞（200μL）＋连接产物10μL感受态细胞（200μL）＋质粒DNA2μL（5－50ng)感受态细胞（200μL）＋无菌水2μL0.1mol/LCaCl2（200μL）＋连接产物2μL对照的作用？？？注意：无菌！轻柔！冰浴！2、转化42℃水浴热激90秒冰浴2分钟3、复苏每管加800μLLB液体培养基37℃慢摇1小时（150rpm）（这段时间铺平板）4、选择性筛选浓缩菌液：离心（4000rpm×1min）吸弃900uL上清，吹悬剩余细胞涂板：取50uL细胞悬液，涂布在选择平板上，倒置培养过夜（37℃）复苏目的？预实验结果阴性对照实验平板仪器使用与注意事项离心前，一定要在超净台中绝对平衡！！！配制液体并高压1.LB液体培养基140mL胰蛋白胨（tryptone)1.4g酵母提取物（yeastextract)0.7gNaCl1.4g140mL水溶解，5mol/LNaOH调节pH值(约28μL)分装：250mL锥形瓶，40mL/瓶×2瓶15ml大试管，4mL/管×14管配制液体并高压2.LB固体培养基(含1.2％琼脂)200mLLB液体培养基200mL琼脂粉2.4g湿热高温灭菌，待温度降到60℃左右加入：Carb(50μg/mL)、Tet(12.5μg/mL)X-gal(70μg/mL)、IPTG(80μmol/L)混匀后立即铺平板10块（约20mL/板）不用溶解不要挂壁均为终浓度下次实验的简介与准备质粒的提取重组质粒的酶切分析电泳分析重组质粒重组质粒转化表达菌株重组子的筛选：阳性重组子转化表达菌株灭菌1.小指管：1.5mL60个2.枪头：20uL/200uL/1mL各2盒5mL8支3.50mL离心管4个下周1、筛选：每人两个单菌落2、接菌