免疫组化步骤(脱蜡到封片)

组织切片的脱蜡处理：1、切片放于切片架中，在室温放置60min后，浸泡在二甲苯中，10min后放入另一个装有二甲苯多的染缸再浸泡10min。2、脱蜡后，将组织切片放入无水乙醇5min，再95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，50%乙醇5min。3、水合处理后，将组织切片放入纯水中孵育5min，再转移放入PBS缓冲液中孵育5min。抗原修复：1、抗原表位修复之前，需进行过内源性氧化物酶的cuimie处理，滴加3%的过氧化氢溶液于切片上（此时，内源性过氧化物酶可被过氧化氢所抑制），湿盒孵育10min。2、用PBS浸泡清洗3次，每次5min。尽可能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入0.01mol枸橼酸缓冲液（0.01M枸橼酸缓冲液），微波炉中大活力加热至沸腾，并保持8min。3、待缓冲液温度自然降到室温，反复2次用PBS再洗5min。免疫反应：1、用滤纸擦去周围多余的PBS，滴加PBS稀释好的10%的正常山羊血清（封闭液），室温湿盒封闭30-60min。2、孵育结束后，去除多余的封闭液，滴加一抗工作液，放入冰箱中4℃孵育过夜。第二天，移去一抗后，用PBS洗2次，每次10min。3、擦去切片周围多余的液体，滴加二抗工作液，室温湿盒孵育30min，移去二抗后用PBS洗2次，每次10min。化学染色：1、去除切片上多余的PBS，滴加新鲜配置的DAB工作液，湿盒孵育，在显微镜下检测染色程度。（达到理想的染色程度时立即终止反应，避免染色时间过长，）2、染色结束后，用PBS浸泡，每次5min，重复3次，洗去DAB液，去除残留液体，苏木素复染2-5min。3、复染结束后，用水洗去多余染液，在“1%盐酸酒精”（配好的一种液体）中分化数秒，再次进行水洗切片。脱水封片：1、与之前相反，先纯水5min，再放入50%乙醇5min，再75%乙醇5min，85%乙醇5min，95%乙醇5min，无水乙醇5min，最后，置于二甲苯中透明化处理2次，每次均10min。2、脱水完成后，擦去切片周围的液体，滴上一滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。