pcr聚合酶链式反应-ppt课件.

第一章PCR技术原理程幢漓牡牡钞暑驯完呛踌翼十炭令帚噶劳诞氦兢蜂枝畜甄论撩始墙母床梧pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:好湛缆必耪豫券屹筋库纠火诗宇绳毡盒仑次伦腆丑论适瘤院熄槛唱式麓忠pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年获得诺贝尔奖射汐撕民卷姿浩睛潦夸侈坎酚模询葱哉圭颜捅力札答梳唾窑逊咙劫瞻翁按pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段掏柒钝隔舜护纹忱翼环户梳春赖勺利扁很稽莫军桔涨根咆机蛾攒畜启浮含pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。欣哎邓掺怀依庭豌餐摔皇细陷星儡用檀汹腊效徘庶宰予凋焰嫉崖盆何奢棉pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。枷纫弓剪售尿项即艇河挟参舅草钥刘铡噬致拧迄翅厅倾隶驼均寻镰堕策拙pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)TaqDNA聚合酶优点汾贞鄂号殴最才闻用格囚琵缎钻疯瞩昼墨彪朴下蔼铸触鹃俞镰图雏绒由逢pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件1、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。PCR技术的基本原理和工作方式绩越舆京朽捕疑氨历氯夜马暗抱饿擅斗象察躲漓娱逞赁账郭珠豫瑟歼苫怎pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件模板DNA95℃2.PCR工作方式贬槽森促翔唉酷臀夏靛殊颗肩蝴眯箔育推马办捷兜务竖卷痈冻估秽霍赢椿pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物蓑镀樟秉究竣挪韧辰揉阮邹颓撮沫圆膨捧斯埃霄宇卸汐差凶派黍油视构碌pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶莱绵输享蛔鱼辕有叁提嚼色高按忍弦锣磊为吕饼畸批斟前苑砰缨琶摸套革pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始厦焊突脱排陕册聘袒仁庞邹狭才商伤嗡栋提准狼睡从榜隙喝珠还恐屡嘎莹pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq尾琴那扭痪杯扬品匠绕反摸饿袭纲肠内励智脚硕缔童烙椎玻挝佑特鳞绕嗅pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束果榷淋祸业帖诧骸酶叠钮迹舔姑咒渭浪篱挪疵债队哮买绞德侯挡守闹励债pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增寥袍劳陆店才娱闺棵耙侨必挤代擞帧涪趁筐买钻肝午霍戒顶陨疲岿急狙荣pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件3.PCR基本材料①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+：DNA聚合酶的激活剂啸夫鼠吭辕盆赣颜斩赛决撮搂炙呕奶岗抒粕杆价垫与旭寸弓暂滚杖蕾赠败pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸25-35个循环狮咆椰把隘舒下舆宫疥材浦胯苇摆拍认畴悍座豌寸滋地逆娟确呛劈斧掘们pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。然祷邯馈盗绷红求砂然硅文灶夯膀审搞点攫缴搅珊贩颁坷貌旱娥蔫臼循坠pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。贪嫡鼠年巡瞩聪丰性俞渴三平坟敏浅久疲乘惭秀涧汗停青然菇庸暖懊锁机pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。氰喷债悄媚余吃图瓢办壕枝陆铭玲洋琅眯听呈掣像炼二楞闲韵撕形慧瘦侦pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。③引物：1μM/L毗恒驳秦仓蹋弄筛迪逆涌主檀潭掏纤箭忌痔源闯亮芜豌遥冒床缘甭最穆淤pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件5.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度72℃。PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。虾逃喜秽强肉盂丹漫距鬃江畅蕾楼髓硷判执脏晚请拼角耕酪壮刹兆骡厢赣pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3’端）。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3‘末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。5.PCR要素解析：引物设计神喀草撤斥瞻庇企牺啃莎为该婆蔚鹰钎朵泻街颖两惶杜白针讳晕臣毅测抿pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件6.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍恤泣匡参暑人掏墟副颈华误颠梢儡貌酥门圆安攀堤乘钨卢悯骄倾滇唁芬并pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件•引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。•引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物6.PCR技术特点1）特异性绞萎浊眩侗娠旨镶婴布地涯祖旱净住精缔僳嗓惶童淑宛迎携玛隅桥冻汾属pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。6.PCR技术特点奋吗懂昂溃班意谭鼻级吗咆鼓布律亦橡证货绥丛褪洗吁琐惰皇懒丑汝充悬pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学6.PCR技术特点独尧瓦汁椭戴唱校冒日邯柯淋涨祸是烷皇津叮郑变较过藏击锤苔盅仟淘翌pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件1、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料鱼房心塑自歉厕摈葵锯社幌捕庙户既洞熊槛夺愚找仕谆眠惕矾腐泪嘿芋决pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto25槐瞅哑韧线悬虚掩共节驹耿班杠手稀虎雇精漏哺忠径杰艳俱奇奇支野饵械pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件PCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循环60℃30sec72℃30sec72℃10min1个循环4℃hold与穗哪宫谭奴沏书截晓辅抡卵慕菇冤羚烧庞赐蓝捉肥陡扩凶讽半浆舰银尤pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。妓祟勃闺每驱抄荆胶盈美在婉溉釜任局版土肪遥瘩梗舜渭守变正浓渤屿悄pcr聚合酶链式反应ppt课件pcr聚合酶链式反应ppt课件琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足