体外冷冻卵细胞技术的研究进展

yjm*梅概念历史回顾冷冻原理卵细胞的冷冻冷冻方法存在问题及展望卵细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使卵细胞在-196℃的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存卵细胞的技术。概念历史回顾1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠胚胎。1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细胞得到活仔。1977年，Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。1985年，Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。1986年，Chen等运用慢速冷冻卵子方法，诞生了世界首例冷冻试管婴儿。1999年首次运用玻璃化冷冻技术冻存人类的胚胎并获得健康女婴的出生。目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。冷冻原理低温冷冻保存的细胞能长期保存而不丧失活性，其原因是因为细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被低温所抑制，细胞内所有化学变化处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存。低温保存的细胞以一定方式复苏后，又具有存活能力。细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐受低温，而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性作用（致死性温区-50~-15℃）一、卵细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水分渗出产生溶液效应。随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生两种情况：（1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解。（2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。这个因素影响是卵细胞冷冻保存的关键。在-5~-15℃细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶就会迅速聚集，释放潜热引起温度瞬间剧增，造成过冷损伤。冷冻的卵细胞解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。卵细胞在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳定性而导致染色体异常。二、保护措施诱发结晶溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温时才结晶，这种现象叫过冷现象，易对卵母细胞造成损伤。为了防止过冷现象的发生，通常在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。使用冷冻保护剂冷冻保护剂作用原理：当冷冻保护剂渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成。在浓度增加到一定程度后，整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，避免“胞内冰晶损伤”。此外，保护剂可改变细胞膜通透性，降低细胞内外渗透压差，避免“溶质性损伤”。非渗透性保护剂这是一类大分子化合物，能溶于水，但不能渗入细胞，较为常用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。在快速冷冻时，可协助渗透性保护剂促使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成；组成玻璃化液时，可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化的相变温度升高、可促进胞质及保护液玻璃化；解冻时，为卵母细胞和胚胎提供一个高渗环境，避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。其他保护剂主要是指最近所发现的一些新型冷冻保护剂，如抗冻蛋白（AFP）。渗透性保护剂渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能够渗透进入胞质内而得名，常用的有甘油（GL）、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类物质在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：①防止细胞因脱水过度收缩；②与水分子发生水合作用，减慢溶液结晶速度；③稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减少盐害作用的产生。玻璃化的保护作用玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。卵细胞的冷冻成熟卵母细胞的玻璃化冷冻的已经运用于临床，未成熟卵的冷冻目前仍处于探索阶段在临床上的卵泡采集中，成熟的卵母细胞只可以来源于新鲜的超促排卵的IVF周期，而未成熟卵母细胞的来源则更加多元，既可以取自多囊卵巢综合(PCOS)患者的卵巢，又可以对于剖腹手术的患者卵巢内直径小于10mm卵泡进行穿刺抽吸。卵细胞的冷冻卵母细胞非常脆弱，MII期卵母细胞处于第二次减数分裂中期，由于体积大、含水分多及染色体排列在纺锤体的赤道板上等原因，成熟卵母细胞的超微结构在冷冻复苏过程中极易受到细胞内冰晶形成所造成的损害，尤其是微观结构对温度变化尤为敏感，在冻融过程中易发生解聚。而对于未成熟的主要指生殖泡期(germinalvesicle，GV)的卵母细胞来讲微结构的不成熟反而成为了低温保存的有利条件，主要表现在：①细胞膜对水的通透性变化小，细胞的分化程度低、形态小、细胞器少且排列和分布均匀；②透明带和皮质颗粒少；③染色体位于生殖泡内，微管结构尚未形成。上述特点都有利于未成熟卵的冷冻保存同时大大降低了染色体异常和冷冻损伤的发生率。冷冻方法慢速冷冻法超快速冷冻法玻璃化冷冻法慢速冷冻法此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎冷冻研究中常用的方法。该法将胚胎置于冷冻保护液中以0.2~0.8℃/min的速率缓慢降至-80℃，然后投入液氮保存。利用这一方法先后对多种家畜和实验动物的胚胎进行冷冻试验并取得成功，但由于其冷冻过程花费的时间比较长（6h以上），而且需要特殊的冷冻降温设备，因此目前已经很少采用。超快速冷冻法超快速冷冻法是把卵母细胞用适当的冷冻保护剂混合液进行短暂处理后，直接投入液氮中，在冷冻过程中细胞内外都形成结晶。玻璃化冷冻法玻璃化冷冻法是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，主要依靠溶液的玻璃化特性，直接将卵细胞投入冷冻保护剂和液氮。利用高浓度的冷冻保护剂，在一196℃的液氮中把细胞或组织固定在玻璃状态的冷冻过程。在玻璃化冷冻过程中，高浓度冷冻保护剂固化，形成无结构的玻璃态，由于其质点不规则排列，始终保持溶液的水分子和离子分布，使跨膜物质的浓度和渗透压差别不大，因而避免了慢速冷冻过程中细胞所遭受的机械损伤，同时又可以消除细胞外冰晶引起的理化损伤，并且缩短了冷冻处理所需的时间，简化了步骤，也不需要昂贵的程序降温仪，逐渐成为卵母细胞冷冻的趋势。玻璃化液的组成较为复杂，包括丙二醇、二甲基亚砜、乙酰胺、聚乙二醇等。玻璃化冷冻法冷冻速率是玻璃化冷冻成功的关键所在，冷冻速率的提高意味着冷冻损伤的减少。成功应用于成熟卵母细胞、未成熟卵母细胞等方面的冷冻保存并取得成功。该技术操作简单、迅速快捷，正逐渐成为人类辅助生殖技术中重要的应用技术之一。由于玻璃化冷冻保护剂的高浓度及高毒性，如何选择最佳冷冻载体并提高冷冻速率一直是相关研究中的热点。存放冷冻胚胎的液氮罐存在问题和展望利用卵母细胞冷冻保存技术可以建立“卵子库”，不仅可以解决目前卵母细胞来源短缺的问题，还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转基因动物生产不受时间和空间的限制，并且代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质资源保存。在人类医学上，卵母细胞的冷冻保存将会为那些由于病理或其它原因造成不孕的病人提供一个挽救生育的机会。玻璃化技术冷冻技术为一种发展迅速的冷冻技术，正逐渐取代慢速冷冻技术，成为辅助生殖领域低温生物学的主流。存在问题和展望但是，卵母细胞的冷冻保存仍然存在着许多尚待解决的问题，如卵母细胞对低温的敏感性很强，冷冻保存后卵母细胞活力、受精率及其发育能力均明显降低。如何采用最佳的冷冻保护剂种类和浓度、采用何种冷冻方案，以最大限度地减少细胞的化学损伤，尽可能的保存细胞、组织的活力，尚未出现统一的标准，仍值得我们更深入、更细致的研究，从而推动这项技术在临床中的广泛应用，以期实现对于女性生育能力的保存。谢谢！