载体构建

载体构建载体种类：1.原核表达载体2.真核表达载体3.病毒表达载体（是真核载体的一种）4.克隆载体构建载体种类取决与实验的需要：1.构建基因表达载体2.构建microRNA表达载体3.构建shRNA干扰载体本实验最常见的载体构建类型：基因表达载体的构建：考虑问题：1.选用什么样的表达载体？1）普通真核表达载体2）病毒载体①慢病毒载体（带GFP）2.基因模板从哪里来？1）PCR从cDNA模板中扩增2）商业化的IMAGE克隆中扩增选择载体的优缺点：1.普通真核表达载体优点：多克隆位点比较多，易于构建缺点：建立稳定转染细胞时间长，耗时耗力慢病毒载体优缺点：优点：构建的慢病毒载体包装成成熟的病毒颗粒感染靶细胞后，很容易整合入细胞基因组，并能稳定表达目的基因缺点：1.多克隆位点很少，克隆基因相对困难2.包装病毒相对麻烦基因模板从哪里来？1）PCR从cDNA模板中扩增引物设计最好采用巢式PCR方法2）商业化的IMAGE克隆中扩增CDS区5‘非翻译区3‘非翻译区初次PCR引物设计（外引物）（内引物）直接设计与载体匹配的引物载体构建具体范例：NESG1基因构建入pEGFP载体中（设计是关键）1）分析NESG1酶切位点①从NCBI()调取NESG1序列ACCESSIONVERSION：NM_012337.2②将NESG1mRNA序列CDS区（蛋白编码区）导入primerpremier5软件中，进行酶切位点分析多克隆位点：MCSEcoRIKpnI尽量选用常见酶切位点，而且可以在同一buffer中酶切效率非常高NESG1模板：直接从商业公司购入Image克隆，所以引物直接在NESG1编码区起始和末端设计。（不需要软件，只要基本保持上下游引物Tm值相近）引物设计：forward5’-CGGAATTCATGCCACTAAGCACAGCTG-3’;reverse5’-ATTGGTACCAGTTCACAGAGGTAGCTGGCA-3’特别注意：1.因为需要与GFP融合表达，所以下游引物去掉了终止密码子TGA2.不要改变GFP表达的编码框aacatcctgccagctacctctgtgaactgaTCA（添加两个碱基，并与载体上的最后一个碱基组成3联体密码）在本次载体构建：可以添加AC,最后与C组成三联体密码（只要不是终止码）后续过程：1.NESG1PCR扩增，纯化，EcoRI和KpnI酶切，纯化2.质粒扩增，提取纯化,EcoRI和KpnI酶切线性化，低浓度琼脂糖电泳，胶回收纯化3.模板与线性化质粒连接4.转化感受态大肠杆菌5.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）shRNA和microRNA慢病毒载体构建•选用载体：在5‘端和3’端分别加上MluI和ClaI酶切位点，3’端加上TTTTT终止序列，设计合成其shRNA的DNAOligo寡核苷酸序列：723Sense:5’CGCGTCCCCGCGGCAGAAATCCATTCAAAGTTCAAGAGACTTTGAATGGATTTCTGCCGCTTTTTGGAAAT3’723Antisense:5’CGATTTCCAAAAAGCGGCAGAAATCCATTCAAAGTCTCTTGAACTTTGAATGGATTTCTGCCGCGGGGA3’谢谢大家！