Western_Blot过程步骤详解

WesternBlot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。9、丽春红染液储存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、脱脂奶粉5%(w/v)。11、NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/LNaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA。（可以参看分子克隆）四、主要步骤主要包括以下4个基本步骤1.样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1．培养细胞或药物处理。2．弃培养基，用1XPBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3．加入1XSDS样品缓冲液(6-wellplate,100μl/w或75cm2plate,500-1000μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。5．煮沸样品5minutes。6．离心12000g,5min，取上清。7．电泳分离：上样15μl~20μl至SDS-PAGE胶(10cmx10cm)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样20~30μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。2.电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）3.转膜杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC)和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。1.将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。3.装配转移三明治：海绵?3层滤纸?胶?膜?3层滤纸?海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。5.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜4.免疫杂交与显色1．用25mlTBS洗膜5min，室温，摇动。2．置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。3．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。5．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。7．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。8．15mlTBS洗1次。9．蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。注意事项：1．操作中戴手套，不要用手触膜。2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。4．某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用1.0%BSA代替Tween-20。5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBSorPBS:能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3%BSAinPBS：低的内源性交叉反应性。6．如用0.1%Tween20、0.02%NaN3inPBSorTBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。五、实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。2.针对样品的常见问题B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，StackingGel3.5％。I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。J.蛋白变性后可以存放多久？解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。L.接下来