第八章细胞凋亡与肿瘤

细胞凋亡与肿瘤ApoptosisandTumor第八章长海医院病理科何妙侠学习要求1掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别2掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤发生的关系3了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点前言对细胞死亡的认识NatureReviews,Molecularcellbiology.2001;2:545PCD—Apoptosis1858年，Virchow开始研究细胞死亡1951年,Glucksman提出程序化细胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)1972年,Kerr提出细胞凋亡（CellApoptosis）SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston2002年英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在细胞凋亡研究工作中取得的杰出成就获诺贝尔生理与医学奖主讲内容细胞凋亡特点细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤主讲内容细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡特点细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程(droppingoff,fallingoff)细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别细胞凋亡是高度有序的基因控制的一系列活性酶参与的过程，是多细胞动物生命现象的重要属性细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别细胞凋亡与胚胎发生发展、个体形成、器官的细胞平衡稳定等有密切的关系蝌蚪尾消失发育过程手足成形过程脊椎动物神经系统发育细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别近年来研究表明，肿瘤的发生与细胞凋亡的异常密切相关；细胞凋亡受抑作为细胞增殖紊乱的对应面在肿瘤发生发展和转归方面均有重要作用。细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别该“死”的细胞不死，如自身免疫性疾病，恶性肿瘤等不该死的细胞死了，可能与老年性痴呆、帕金森症等有关细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别细胞凋亡与衰老密切相关细胞凋亡对维持机体的遗传稳定性起着重要的作用老化细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别程序性死亡是功能上的概念，而细胞凋亡是形态学上的概念，不是所有的程序性死亡都表现为凋亡，即不一定存在凋亡的形态学改变细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别凋亡细胞形成多个大小不等有膜包裹的凋亡小体（apoptoticbodies）内含形态保存完好的细胞器和/或浓缩的细胞核碎片，后期被吞噬细胞清除细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别1受基因调控，死亡过程具有程序性，需要某些基因的启动并合成新的RNA和蛋白质细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别2形态学上表现为细胞皱缩、染色质沿核膜聚集、胞体胞核裂解包裹形成凋亡小体细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别3常单个存在于组织中4周围组织无炎症反应细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别5DNA片段化：琼脂凝胶电泳可见特殊的阶梯状由不同倍数的l80～200bp核苷酸组成DNA梯带图6合成一些大分子物质细胞凋亡特点概念意义形态变化基本特征与坏死区别细胞凋亡与细胞坏死的区别特点细胞凋亡细胞坏死发生原因形态特征受累范围细胞膜细胞体积染色质细胞核细胞器凋亡小体周围组织生化特征调控DNA降解蛋白质合成对ATP要求生理性或病理性多为单个或散在细胞仍保持完整固缩变小聚集在核膜下，呈半月形先固缩后降解仍保持完整有，被临近细胞或巨噬细胞吞噬无炎症反应整个过程受基因调控主动进行有规则，电泳呈梯状DNA谱带有必需病理性多为连续大片组织细胞完整性破坏肿胀增大分散凝集，呈絮状溶解肿胀，内质网明显崩解无，后期细胞破裂溶解，残屑被巨噬细胞吞噬有炎症反应整个过程均被动进行无规则，电泳多呈弥散状无无需主讲内容细胞凋亡特点凋亡调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡检测细胞凋亡检测形态学观察细胞膜完整性DNA断裂凋亡定量检测凋亡定位检测细胞凋亡检测形态学观察细胞膜完整性DNA断裂凋亡定量检测凋亡定位检测1光学显微镜观察优点：光镜技术简单、快速，能短时间内进行大样本分析缺点：样本制备复杂、耗时形态计数常受到主观因素干扰重复性差细胞形态学的检测2电子显微镜观察优点：可显示凋亡细胞的许多形态学特点尤其是膜结构和细胞器的变化主要用于获取细胞凋亡的定性资料缺点：样本制备复杂、耗时细胞形态学的检测细胞凋亡检测形态学观察细胞膜完整性DNA断裂凋亡定量检测凋亡定位检测1台盼兰（Trypanblue）染色法台盼兰为细胞膜非通透性活性染料，坏死细胞着色，而活细胞与早期凋亡细胞不着色意义：方法简单、便捷；常常用于细胞死亡的初步评估细胞膜完整性的检测2丫啶橙（acridineorange,AO）和溴化乙啶（ethidiumbromide,EB）双染法AO和EB都能结合DNA的荧光染料，可分别产生兰色和橙色荧光，其中AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞细胞膜完整性的检测AO/EB双染法意义可用于荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死细胞或继发性坏死细胞较台盼兰染色精确、详细细胞膜完整性的检测细胞凋亡检测形态学观察细胞膜完整性DNA断裂凋亡定量检测凋亡定位检测琼脂糖电泳法琼脂糖凝胶电泳中细胞凋亡呈现具有特征性的“阶梯”（DNAladder）样条带外观坏死细胞则因DNA的随机降解却常出现弥散样外观DNA断裂的检测JClinPathol:MolPathol2000;53:55–63JClinPathol:MolPathol2000;53:55–63琼脂糖电泳法缺点：目前已被更为敏感的同位素标记、原位末端标记技术所替代DNA断裂的检测细胞凋亡检测形态学观察细胞膜完整性DNA断裂凋亡定量检测凋亡定位检测流式细胞仪检测（flowcytometry,FCM）几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生化和分子特点都可利用FCM的单参数和/或多参数分析进行检测优点：单个细胞分散相中辨别凋亡细胞；快速、准确；应用范围广快速准确的定量分析细胞凋亡检测细胞膜完整性形态变化DNA断裂凋亡定量检测凋亡定位检测AnnexinV检测技术原理：磷脂酰丝氨酸（PS）外翻是早期凋亡细胞的重要形态特征之一，而依赖Ca2+的磷脂结合蛋白AnnexinV则具有与PS高亲和结合特性，将其作为检测细胞膜表面PS的敏感探针试剂，用于凋亡细胞检测敏感的定位检测AnnexinV检测技术优点：1对凋亡细胞进行定性及定位检测2同时使用膜非通透性DNA染料如PI等，就能从AnnexinV染色细胞中将凋亡和坏死细胞区别开来：凋亡细胞(-)，坏死细胞(+)敏感的定位检测ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PIDNA检测技术原理：根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的碱基缺失部分的基本原理，应用同位素或非同位素（如生物素，FITC等）标记的三磷酸核苷酸（dNTP）形成新的DNA，以了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量原位末端标记检测优点：常用荧光素FITC标记物，故可以通过FCM或荧光显微镜检测相应细胞的携带荧光强度，进行快速定性、定位、定量及大批量细胞悬液或涂片的回顾性研究，是当前较流行的一类细胞凋亡评判方法原位末端标记检测标记方法（1）DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移(insitunicktranslation，INST)（2）末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法(Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)原位末端标记检测TUNEL法的优点1定性和定位：对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映凋亡细胞最典型的生物化学和形态特征2可用于多种来源标本：如细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等3操作简单，灵敏度高：直接标记步骤少，操作简便，且间接标记有信号放大的作用原位末端标记检测1端粒酶检测：90%的凋亡都具有端粒酶活性2mRNA水平检测：通过检测fas,Bax-α和bcl-X基因的mRNA表达水平可反映细胞凋亡的水平3细胞内氧化还原状态：谷胱甘肽状态检测4细胞色素C定位检测：细胞色素C存在于线粒体内外膜之间，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞质，结合Apaf-1启动级联反应5线粒体膜电位变化：线粒体膜电位耗散启动凋亡其它凋亡检测方法细胞凋亡检测方法小结定性和定量定性：琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电子显微镜和荧光显微镜）定量或半定量：流式细胞仪法、原位末端标记法、ELISA定量、琼脂糖凝胶电泳区分凋亡与坏死可区分：琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（透射电子显微镜最可靠）、PI双染色法流式细胞仪检测无法区分：原位末端标记法、PI单染法流式细胞检测细胞凋亡检测方法小结标本来源不同组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)培养细胞：几乎所有方法凋亡时期不同早期：细胞外膜磷脂酰丝氨酸的检测、细胞内氧化还原状态改变检测、细胞色素C定位检测、线粒体膜电位变化的检测晚期：原位末端标记法、琼脂糖凝胶电泳、端粒酶检测主讲内容细胞凋亡特点细胞凋亡检测细胞凋亡与肿瘤发生调控机制凋亡发生调控机制凋亡发生过程凋亡相关因素凋亡调控机制凋亡信号通路凋亡调控基因凋亡发生调控机制凋亡发生过程凋亡相关因素凋亡调控机制凋亡信号通路凋亡调控基因诱导启动信号传递凋亡实施吞噬搬运各种凋亡诱导分子(细胞内/外)线粒体途径(P53bcl-2家族)死亡受体途径(Fas-Fas配体)Caspase8Caspase9Caspase3细胞凋亡1接受凋亡信号2凋亡调控分子间的相互作用3蛋白水解酶（Caspases）的活化4凋亡的级联反应凋亡发生过程诱导期：诱导期是由特定的凋亡诱导信号所决定的效应期：活化的“中央处理器”（centralexecutioner）启动和“宣判”细胞迅速进入降解期降解期：出现特征性形态学和生物化学改变凋亡过程分期凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在，以形成完整的反馈环路，使凋亡过程受到精确严密的调控凋亡发生调控机制凋亡发生过程凋亡相关因素凋亡调控机制凋亡信号通路凋亡调控基因（一）诱导性因素细胞凋亡是一个程序化的过程，正常情况下它并不“随意”启动，只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用时才会启动凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。在少数情况下细胞凋亡可自发产生，但多数是在诱导因素的作用下发生凋亡相关因素1.激素和生长因子失衡生理水平的激素和生长因子是细胞正常生长不可缺少的因素，一旦缺乏，细胞会发生凋亡；相反，某些激素或生长因子过多也可导致细胞凋亡，例如：强烈应激引起大量糖皮质激素分泌，后者诱导淋巴细胞凋亡，致使淋巴细胞数量减少凋亡相关因素2.理化因素射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等，均可导致细胞凋亡。例如：电离辐射可产生大量氧自由基，使细胞处于氧化应激状态，DNA受损，引起细胞凋亡凋亡相关因素3.免疫性因素免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳、监视功能中，可释放某些分子导致免疫细胞本身或靶细胞的凋亡。例如：细胞毒T淋巴细胞（CTL）可分泌颗粒酶（granzyme），引起靶细胞发生凋亡凋亡相关因素4.微生物学因素细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。例如：HIV感染时，可致大量CD4+T淋巴细胞凋亡凋亡相关因素5.其他如缺血与缺氧，神经递质（如谷氨酸、多巴胺），失去基质附着等因素都可引起细胞凋亡。在肿瘤治疗中，单克隆抗体、反义寡核苷酸、抗癌药物等均可诱导肿瘤细胞凋亡凋亡相关因素（二）抑制性因