电泳分离概述

12主要内容1概述2电泳的分类3聚丙烯酰胺凝胶电泳4SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳5等电聚焦电泳31809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。一、概述1、电泳的发展史41948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。5电泳：带电荷的物质（如蛋白质、核酸等）处于惰性支持介质（固态或液态）中，在电场的作用下，向其相反的电极方向泳动的现象。电泳分离：带电物质在电场的作用下，因其所带电荷性质、电荷数量以及分子量大小的不同而产生的泳动方向、泳动速度的不同，最终使得混合组分得以分离的操作单元。2、电泳的概念6电泳分离的基础建立在蛋白质是带电颗粒这一事实上的。蛋白质的电荷来源于氨基酸的离子化侧链基团，包括酸性残基，、碱性残基、络氨酸残基以及荷电的非蛋白质组分如脂类或者碳水化合物。大多数这些酸和碱都很弱，使得蛋白质的整体电荷具有很大的pH依赖性。而在一特定的pH下，不同蛋白质分子由于氨基酸组成不同，所带电荷的电性和电量也不同，由此可进行蛋白质的分离和分析。3、电泳分离的基本原理7带电粒子在单位电场强度下的泳动速度称为电泳迁移率。m=v/E=(d/t)/(V/L)式中，m为迁移率；v为迁移速度；E为电场强度；d为迁移距离；t为电泳时间；V为电压；L为凝胶长度；由于球形分子在电场中收到的动力和阻力，即EQ=6πrηvQ为别分离物质所带静电荷；η为介质黏度；r为分子半径；于是有m=Q/6πrη即迁移率和球形分子的半径、介质黏度、颗粒多带电荷有关。89内在特性：颗粒性质（静电荷量、颗粒大小、形状）外在特性：电场强度、溶液的离子强度、pH值、电渗作用、电泳介质的性能。1）颗粒性质Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。4、影响迁移率的因素102）电场强度单位长度的电位降称为电场强度，也叫电势梯度（V/m）。如电泳槽长20cm，电压200V，则电场强度200÷20=10V/cm。电场强度越大，电泳速度越快，但是会产生大量热量，需要配备冷却设备。常压电泳E：2－10V/cm电压：100－500V，大分子物质分离。高压电泳E：20－200V/cm电压500V，小分子物质分离。113）溶液离子强度离子浓度过高引起带点质点吸引相反粒子聚集其周围，形成一个与带点质点电荷相反的离子氛，通过降低带电粒子量和增加阻力使运动质点迁移速率降低；则电流过大、产热过多，使区带变宽、蛋白质变性。12溶液离子强度过低降低缓冲液的总浓度和缓冲剂量，不宜维持溶液的pH值，进而影响溶质的带电量；其次蛋白质之间有时候会发生相互静电作用，形成更大的分子团，影响迁移速率；而且电泳过程中由于电子流动产生热量，所以解决设备温度控制问题成为电泳和电色谱设备放大的难题。134）溶液pH值溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液145）电渗作用电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动称为电渗。固体支撑物多孔且带有可解离的带电基团，解离后常吸附溶液中带正电或负电的反离子，这些反离子不是固定的，随着电压梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。总体效果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。电渗影响带电质点的迁移速度。但在保持一定的电渗流是有益的，比如免疫电流。156）电泳介质的性能样品的扩散或对流会干扰样品的分离，为此可以使用支持介质以防止电泳过程中的对流和扩散。支持介质必须是化学惰性的，且均匀，化学稳定性好，且具有合适的渗流。165、检测方法电泳结束后，被分离的蛋白质区带仍然保持在胶内，这时可以通过染色而显示出分离图谱，从而检测样品的分离情况。常用的全蛋白质染色方法有：考马斯亮蓝法、银染色法，荧光染色法。考马斯亮蓝法通过范德瓦尔斯键结合到蛋白质的碱性集团上，适用于对蛋白质和肽进行染色。通常先用三氯乙酸和/或甲醛等试剂固定凝胶上的蛋白质，然后将凝胶浸泡在染色液中染色，最后将凝胶浸与乙酸/乙醇脱色液中脱色目的为了除去多余的燃料，直至背景清晰。染色后，考马斯亮蓝凝胶可以湿保存（浸泡在10%乙酸溶液中密封）或者干保存。17银染色法银染色法是更灵敏的蛋白质染色方法，银染时蛋白带上的AgNO3被还原成金属Ag而沉积在蛋白带上。现在常使用即用型银染试剂盒进行银染。银染过程中蛋白质先固定、在显色。常用的固定剂有戊二醛，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸，固定能阻滞蛋白质在凝胶中的扩散。银染的显色方法主要有化学显示和光显示两种。18荧光染料法荧光染料可以时染料本身发荧光，或者是染料与蛋白质的反应产物发荧光。荧光染料法分为电泳前预标记和电泳后再标记两种方法。电泳前预标记蛋白质主要采用丹磺酰氯、荧光胺、领苯二甲己二醛等，特别是荧光胺近年来采用较多。电泳后蛋白带的迅速定位可以用邻苯二甲基二醛、荧光胺、1-苯胺-8-萘磺酸盐进行荧光标记。195、电泳的实验一般方法步骤1）制胶2）加样3）电泳4）检测5）电泳结果的保存20（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V～50000V）6、电泳常用设备21（2）电泳槽：电泳系统的核心部分。自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽22（3）附属设备：外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却。灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。231、按是否产生区带自由界面电泳：移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳，分离后不产生区带。区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。6、二、电泳的分类242、按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳。②色谱电泳③醋酸纤维素薄膜电泳④凝胶电泳：以淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶为电泳载体。⑤聚焦电泳：如等电聚焦电泳、密度梯度电泳、亲和电泳等。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持介质。253、按电泳次数、方向①一维电泳：仅一个方向电泳一次。②二维电泳：平面X轴、Y轴方向各电泳一次。4、按操作方式分①连续电泳：连续进样。②间歇电泳：分批进样。5、按电泳介质是否均匀分①连续介质电泳：电泳介质密度均匀一致。②不连续介质电泳：电泳介质上层密度低为浓缩层，下层密度高为分离层。266、按电泳设备分1）平板电泳：水平平板电泳：有分置于两侧的缓冲液糟和中间的水平冷板的凝胶组成，缓冲液与凝胶通过滤纸桥或者凝胶条搭连。水平平板电泳的特别优势在于电极缓冲液用量很少，缓冲液凝胶条使用很方便，特别是当分析标记蛋白质时可大量减少放射性污染；另外就是良好的冷却系统，从而可以采用高点压，既提高了分辨率，又缩短了电泳时间。垂直平板电泳：上下两个电泳槽，中间经垂直平板相连，凝胶加在两块垂直平行玻璃或塑料板之间。27一般平板电泳：凝胶载体为惰性材料，只起支撑作用，无分离作用，如淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。特殊平板电泳：载体除支持作用外，主要起分离作用，如等电聚焦电泳、pH梯度电泳、密度梯度电泳、亲和电泳等2）管状电泳：又叫圆盘电泳，有上下两个电泳槽，上电泳槽有若干小孔，用于插电泳管，现在电泳管越来越细，以提高分辨率和微量化。各电泳管分别制胶，因此不够简单、均一、准确，目前很少使用了。取而代之的是平板电泳，而自身逐渐演变成更细更长的毛细管电泳。另外由于凝胶管与电泳液直接接触，容易导致液体泄漏、短路、断路等。2829聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。PAGE是目前最常用的电泳方法。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳301、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳一方面根据蛋白质电荷密度，也就是在缓冲液中不同蛋白质间同性静电荷的差异，另一方面基于分子筛效应，即与分子大小和形状有关，因此用聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅能分离各种蛋白质分子的混合物，还可以研究其特性，如电荷、分子量、等电点乃至构想，并且可以用于蛋白质纯度的鉴定。另外不连续的PAGE，对蛋白质的分离不仅基于上面的分子筛效应，还基于对样品的浓缩效应。312、分离效应PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统；不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系；电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应连续PAGE321）电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。在直流电场作用下电泳情况示意图图中A，B，C均为阴离子分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同QA=QB=QC。333）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。348.38.38.96.71.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。3、系统的不连续性表现在以下几个方面354、聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光TEMED的存在，可加速聚合。.CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=OC=ONH2NH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺3738（1）催化剂和加速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40－60分钟内完成。（2）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。（3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。（4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。（5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合。5、影响丙烯酰胺聚合的主要因素39聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺＋N,N’－亚甲