35-DNA的重组

DNA的重组DNARecombination第35章目录生物化学与分子生物学教研室——孔登目录DNA重组DNA重组是细胞内经常发生的过程，是指整段DNA在细胞内或细胞间甚至不同物种之间进行转移或交换，并在新的位置上进行复制、转录及翻译的现象DNA重组的意义DNA重组是自然界的常见现象。它在物种变异、进化、两性繁殖、基因表达和调控以及基因激活等方面都具有重要作用。遗传重组DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称为遗传重组或基因重排。重组产物称为重组体DNA目录DNA重组的类型转座重组(transpositionrecombination)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，其方式主要包括以下类型：目录概念：发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称为一般性重组，是最基本的DNA重组方式。它是由两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，产生单链或双链片段交换的过程。特点：不需要特异DNA序列，而是依赖两分子间的序列的相同或相似性（同源性）。机制：可用1964年RobinHolliday提出的Holliday模型解释。一、同源重组目录Holliday模型中，同源重组主要有4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐。②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应链连接，形成Holliday中间体。③通过分支移动产生异源双链DNA。④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)由于切开的方式不同，得到两种不同的产物：（一）Holliday模型内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体目录旋转目录片段重组体：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。目录同源重组的意义同源重组是最基本的重组方式，参与各种重要的生物学过程。同源重组与DNA复制和重组修复过程密切相关。同源重组在基因加工、整合和转化中起重要作用。目录（二）同源重组有关的酶：研究最多的是大肠杆菌，大肠杆菌的同源重组需要数十种酶的参与，其中最关键的是：RecA蛋白、RecBCD复合物及RuvA、B、C蛋白。目录RecA蛋白RecA蛋白有两个主要功能：①诱发SOS反应；②促进DNA单链与同源双链分子发生链的交换。RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在DNA单链上，形成螺旋状纤丝。线性RecA—ssDNA复合物可以通过插入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物，并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子，从而完成DNA重组。目录目录RecBCD蛋白该酶的亚基分别由recB、recC和recD基因编码该酶具有三种酶活性：①依赖ATP的核酸外切酶活性；②ATP增强的核酸内切酶活性；③需要ATP的解旋酶活性。该酶利用ATP水解提供能量，沿着DNA链运动，并以较快的速度将前方DNA解旋，当遇到chi（因交换位点的DNA结构类似于希腊字母χ而得名）位点（5GCTGGTGG3）时，可在其下游切出3末端的游离单链。从而使DNA重组成为可能。大肠杆菌共有1009个chi位点，分布在DNA的各部位，是重组热点。目录（三）细菌的基因转移与重组细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组随时适应环境的改变。这种遗传信息的流动可以发生在细菌种属内，也可发生在种属间，甚至也发生在细菌与高等动植物细胞之间。细菌的基因转移与重组有四种方式：接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)细胞融合(cellfusion)目录1.细菌的接合作用细菌的细胞相互接触时，遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞，称为接合作用。通过接合而转移DNA的能力来自接合质粒，能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子，简称为性因子或F因子。目录质粒是细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。F质粒是大质粒，可在细胞内游离存在，也可整合到宿主染色体内。F质粒含有多个与基因转移有关的基因，其中性菌毛蛋白编码基因能表达形成细菌的表面性菌毛。每一F阳性细胞约含有2~3条性菌毛。目录游离F质粒的接合过程当F+细胞与F-细胞相遇时，F+细菌性菌毛识别F-细菌，并通过其性菌毛固着F-细菌，再通过回缩与拆卸作用使两细胞彼此靠近，在两细胞间形成菌毛连接由F+细胞的内膜蛋白—TraD蛋白构成转移通道。兼有切口酶和解螺旋酶活性的TraI蛋白在TraY蛋白的协助下结合到质粒DNA的转移起点oriT上，并切开F+质粒的一条链，形成单链切口，游离的5末端向F-细胞转移。随后在两细胞内分别以单链DNA为模板各自合成互补链，结果F-细胞转变为F+细胞。目录可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子F+F-性鞭毛连接酶切单链TraDTraI目录整合F质粒的接合过程整合在宿主染色体中的F质粒发生接合转移时，质粒转移起点被切开，其前导链引导染色体DNA单链转移。进入受体菌后的单链DNA复制成双链形式，并可与受体菌染色体发生位点特异的重组。但往往不能使受体细胞转变为F+细胞。整合的F因子被切割时，有时切割不精确而带有部分宿主染色体基因，称为F因子。F细胞与F-细胞杂交时，宿主细胞部分染色体基因随F因子一起进入了受体细胞，使受体细胞也变成F细胞。细胞基因的这种转移过程称为性导。目录2.细菌的遗传转化(genetictransformation)细菌品系由于摄取了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状改变的现象称为遗传转化。能够摄取周围环境中游离DNA分子的细菌细胞称为感受态细胞。虽然在特定生理状态下细菌细胞所形成的感受态是瞬间的，但在自然条件下多种细菌具有摄取外源DNA的能力。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目录转化的过程转化需有多种酶和蛋白因子参与，如：感受态因子、膜联结的DNA结合蛋白、自溶素及多种核酸酶等。感受态因子可诱导与感受态有关的蛋白表达，自溶素能使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶暴露。当外源DNA与细胞表面的DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其一条链降解，另一条链被摄取，并与感受态特异蛋白结合转移到染色体，与染色体DNA重组。有的细菌能摄取双链DNA。目录CaCl转化法：由于有些细菌自然转化效率很低或不发生转化，基因工程中常采用高浓度的CaCl处理大肠杆菌，增加细胞膜的通透性，诱导感受态细胞的形成，提高重组质粒的转化效率。目录3.细菌的转导(transduction)普通性转导：是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌。局限性转导：某些温和噬菌体在装配噬菌体颗粒时，将宿主染色体整合部位的部分DNA取代噬菌体部分DNA被切下来，组装成噬菌体颗粒带入受体菌。概念：通过噬菌体将细菌基因从供体细胞转移到受体细胞的过程称为转导(transduction)。类型：两种：普通性转导和局限性转导。目录λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)4.细菌的细胞融合在有些细菌的种属中，可发生由细胞质膜融合而导致基因转移和重组。目录概念：在重组酶催化下，在两个DNA序列的特异位点之间发生的重组作用称为特异位点重组(site-specificrecombination)三、特异位点重组结果：取决于重组位点的位置和方向。①重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，发生倒位重组；②重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，形成切除重组；③重组位点在不同DNA分子上，发生整合重组目录重组位点反方向位于同一DNA分子—倒位重组重组位点同方向位于同一DNA分子—切除重组目录作用：①某些基因表达调控；②发育中程序性DNA重排；③某些病毒和质粒复制循环过程中发生的整合与切除等。种类：①λ噬菌体DNA的整合与切除;②细菌的特异位点重组；③免疫球蛋白基因的重排；目录1.λ噬菌体DNA的整合与切除目录λ噬菌体DNA与宿主DNA的特异重组位点称为附着位点。噬菌体DNA的附着位点为attP，细菌DNA相应的附着点为attB，二者含有共同的核心序列称为O区。噬菌体DNAattP位点的序列以POP表示，细菌DNAattB位点序列以BOB表示。λ噬菌体DNA的整合与切除都是在特异位点进行目录attPattPO区POPBOBattBattBO噬菌体DNA细菌DNABOPPOBattLattR噬菌体整合Int，IHF切除Int，Xis，IHF切除时，需要将原噬菌体两侧的附着点联结到一起，由噬菌体编码的Xis蛋白参与切除。整合酶作用于POP和BOB序列，分别将两DNA分子切开，然后再交互连接，使噬菌体DNA被整合，其两侧形成新的重组位点BOP(attL)和POB(attR)。整合所需要的重组酶由λ噬菌体编码，称为λ整合酶(Int)，还需要由宿主编码的整合宿主因子(IHF)。目录GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTGCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATT共同的核心序列O区GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTGCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATT交叉连接噬菌体DNA细菌DNA目录2.细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。但有少数细菌呈现另一H抗原，这种现象称为鞭毛相转变。这种抗原相位的改变是由一段995bp的DNA——H片段，发生倒位重组所致。目录例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个基因族编码轻链(和)，一个基因族编码重链。轻链基因族的基因片段：重链基因族的基因片段：LVJCLVDJC前导片段可变片段连接片段恒定片段多样性片段目录重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)目录其九核苷酸序列提供最初的识别位点，七核苷酸序列为切割位点。催化这种基因重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。RAG1识别信号序列，然后RAG2加入形成复合物，共同促进重排。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC11TGTTTTTGG重组信号序列基因片段回文七核苷酸序列富含A九核苷酸序列间隔称为12~23规则V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯