DNA重组技术

目录重组DNA技术RecombinantDNATechnology目录重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1985年K.Mullis的聚合酶链式反应技术1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉目录第一节重组DNA技术概述OverviewofRecombinantDNATechnology目录一、重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）“克隆”就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝”目录技术水平：分子克隆(molecularcloning)即DNA克隆生殖性克隆(动物克隆)治疗性克隆DNA克隆(DNAcloning)通过一系列操作在体外获得大量相同DNA分子的技术，也称分子克隆(molecularcloning)或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)。目录（二）分子(DNA)克隆可以产生大量相同的DNA分子利用分子克隆手段,可以获得大量相同的DNA分子,这主要基于DNA分子能构建到克隆载体中形成重组DNA分子,并在宿主细胞中复制,通过这种方式,重组DNA被扩增。目录二、重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作重组DNA技术(recombinantDNAtechnology),即在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件(又称载体)中,形成重组的DNA分子,并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。又称分子克隆、基因克隆、基因工程或遗传工程。目录以质粒为载体的DNA克隆过程目录目录第二节重组DNA技术常用分子工具MolecularToolsinRecombinantDNATechnology目录一、工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途限制性内切核酸酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性内切核酸酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录目录（一）限制性内切核酸酶是重组DNA重要的工具酶定义:限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目录作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目录BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目录同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ目录同尾酶（isocaudarner）有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA目录（二）连接酶可将具有配伍末端的DNA片段共价连接连接酶的作用机制目录（三）构建重组DNA分子还需要其他工具酶碱性磷酸酶能去除DNA分子的5-磷酸基DNA聚合酶和核酸外切酶用于修剪限制性片段的末端脱氧核苷末端转移酶用于DNA分子加尾以构成粘性末端目录将粘性末端转变成钝性末端3对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3–OH端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成钝性末端。GCTTAAOH3535GAATTCTTAA535DNA聚合酶EcoRⅠ目录将粘性末端转变成钝性末端CTGCACG3对3粘性末端的片段，应用如T4DNA聚合酶的3→5的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变成钝性末端。核酸外切酶5353G535PstⅠ目录53553353OHGGGGGdGTP末端转移酶末端转移酶加尾目录二、克隆载体可容纳外源DNA且具有自我复制能力载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA目录克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。目录载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；应有高的拷贝数。目录1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。目录pBR322的物理图谱目录目录λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列目录3.粘性质粒(cosmid)目录酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他目录三、宿主细胞为重组的DNA分子提供扩增、筛选和表达的场所宿主细胞（hostcells）是重组分子进行繁殖的场所。理想的宿主细胞通常是DNA或蛋白质降解系统缺陷株或重组酶缺陷株，因而具有较强地接纳外源DNA的能力，保证外源DNA能长期、稳定地遗传或表达。目录第三节DNA克隆DNACloning目录重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达以质粒为载体的DNA克隆过程目录目录一、DNA克隆的核心过程是构建重组DNA分子（一）构建重组载体产生DNA杂合分子目录1.根据目的选择适宜的克隆策略2.通过限制性内切酶水解载体及外源片段产生配伍末端（1）限制酶水解载体使成为线性分子（2）根据目的选择外源DNA的来源（3）限制性内切酶水解外源DNA片段以产生与载体配伍的末端目录3．DNA连接酶将载体DNA与外源DNA连接(1)粘端连接(2)平端连接(3)同聚物加尾连接(4)人工接头(linker)连接目录BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连同一限制酶切位点(单酶切)连接目录不同限制酶切位点(双酶切)的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABglⅡ切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA连接酶15℃重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录目录平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目录目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15℃重组体载体自连目的基因自连目录目录同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。目录5335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶53355335λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶53T(T)nTT(T)nT3553A(A)nAA(A)nA35末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT4DNA连接酶15℃重组体目录目录人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。目录人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5-3-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录目录（二）重组分子可通过扩增、筛选与分离鉴定而获得1.将重组DNA导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法①将外源DNA转入细菌的过程称转化(transformation)②将外源DNA直接转入动物细胞的过程称转染(transfection)③采用包装病毒将外源DNA转入细胞的过程称感染(infection)目录2．标志筛选和序列分析可用于重组子的筛选和鉴定（1）质粒的抗性基因是转化菌的筛选标志（2）用插入失活筛选重组子（3）标志补救(markerrescue)是筛选转化酵母的常用方法（4）限制性图谱和核酸序列分析可直接鉴定外源DNA目录(插入失活法)抗药性标记选择目录目录α互补pBR322目录α互补的检测目录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录目录二、利用重组DNA技术可分离、克隆单个基因（一）候选基因有染色体DNA和cDNA两种来源待克隆DNA的来源可以是染色体DNA，也可以是cDNA。这需根据实验目的进行选择。如果对蛋白质的氨基酸序列感兴趣则采用cDNA为来源的克隆策略。如果对基因的表达调控或编码区的间隔序列感兴趣，则选择基因组DNA克隆的策略。可以通过构建基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)或cDNA文库(cDNAlibrary)来克隆目的基因。目录组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcosco