DNA重组技术的基本工具(讲课)

你还记得我们吗？•氢键•磷酸二酯键•DNA聚合酶•限制性内切酶•DNA连接酶•运载体选修3生态工程生物技术的安全性和伦理问题胚胎工程细胞工程基因工程现代生物科技专题专题1.基因工程的基本内容基因工程的概念1.1基因工程的基本工具1.2基因工程的基本操作程序基因工程的发展史1.3基因工程的应用1.4蛋白质工程的崛起基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。•别名：•操作环境：•原理：•操作水平：•结果：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。基因工程的产物基因工程的概念1.1基因工程的基本工具基因工程的发展史（自学了解）普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫基因)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)转基因棉花植株上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？•解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——运载体1.1、DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”--“分子缝合针”--“分子运输车”--限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体•1、简称：•2、分布：•一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”主要在原核生物中限制酶寻根问底(P4)•你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。限制酶在原核生物中的作用思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。限制酶的识别特点•以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列••如：GAATTCCCCGGG•CTTAAGGGGCCCEcoRⅠ（在G与A之间切割）SmaⅠ（在G与C之间切割）HindⅢ（在A与A之间切割）GAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCCAAGCTTTTCGAA中轴线（专一性）•3、特点:••一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”•识别特定核苷酸列,切割特定切点（专一性）切点：磷酸二酯键EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback•什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端•④作用：•⑤结果：一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”切割DNA产生黏性未端和平末端•3、特点:•••4、作用：•5、结果：1、简称：2、分布：工具1：限制性核酸内切酶主要在原核生物中限制酶识别特定核苷酸列,切割特定切点（专一性）切割DNA产生黏性未端或平末端•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切1、作用:把DNA片段拼接成新的DNA，2、作用原理：催化磷酸二酯键形成,不是氢键二、DNA连接酶——“分子缝合针”可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶3、类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端DNA聚合酶DNA连接酶用途寻根问底(P6)•DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键作用对象DNA复制基因重租4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较3、类型①E·coliDNA连接酶来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端②T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端2、作用原理：催化磷酸二酯键形成1、作用:：工具2：DNA连接酶把DNA片段拼接成新的DNA，4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较例.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？…CTGCA…G①…AC…TG②CG…GC…③…G…CTTAA④G…ACGTC…⑤…GC…CG⑥GT…CA…⑦AATTC…G…⑧②和⑦能连接形成…AC…TGGT…CA…④和⑧能连接形成…G…CTTAAAATTC…G…CG…GC……GC…CG③和⑥能连接形成①和⑤能连接形成…CTGCA…GG…ACGTC…反向对称4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P71、载体必须具备的条件：①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；②具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有某些标记基因，便于进行筛选。④对受体细胞无害三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”•2、常用的载体：••质粒，•λ噬菌体的衍生物，•动植物病毒等能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因3、质粒本质：小型环状DNA分子。分布：许多细菌、酵母菌等生物工具3：运载体1、需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的染色体DNA上复制⑶有某些标记基因，便于筛选⑷对受体细胞无害2、常用运载体：质粒、λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。思考与探究P7•2和7能连接形成…ACGT……TGCA…；•4和8能连接形成…GAATTC……CTTAAG…；•3和6能连接形成…GCGC……CGCG…；•1和5能连接形成…CTGCAG……GACGTC…。教材P7思考与探究1•1、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶反馈练习：2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD3、下列不适合用于基因工程的运载体是（）A、质粒B、噬菌体C、细菌D、病毒选我C4、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”选我D审题5、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G(1)其中①和是由一种限制酶切割形成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是。（2）和是由另一种限制酶切割形成的末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是。反馈练习：1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明技术发明命使基因工程的实施成为可能1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)细菌中发现了第一个限制酶1977年科学家又发明了DNA序列分析方法1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术•4)DNA体外重组的实现1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.1973年科学家才将质粒作为基因的载体使用这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验1973年科恩第一个建成“基因工程菌”，并创立基因工程模式1973年称这“基因工程元年”，科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利技术5)重组DNA表达实验的成功1980年第一个转基因小鼠问世1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”1983年培育出第一例转基因烟草1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明