酶促反应动力学

第三章酶促反应动力学学习目的：1、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。2、掌握0、1级和米氏酶促反应动力学及应用原理；3、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征；4、具备固定化酶反应中的过程分析能力和内外不同阶段的固定化酶动力学的应用能力；5、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学行为。第三章酶促反应动力学第一节均相酶促反应动力学第二节固定化酶促反应动力学第三节酶的失活动力学酶促反应（Enzymaticreaction）：研究酶促反应研究生物反应的基础酶促反应动力学酶催化反应机制对酶促反应速率的规律进行定性或定量的描述建立反应动力学方程确定适宜的操作条件酶促反应特征优点：反应在常温、常压、中性pH范围进行，节能且效率高。反应专一性强，副产物生成少；反应体系简单，反应最适条件易于控制。不足：反应仅限少数步骤，经济性差；反应周期较长；第一节均相酶促反应动力学一、酶促反应动力学基础二、单底物酶促反应动力学1、米氏方程2、操作参数对酶促反应的影响3、抑制剂对酶促反应速率的影响三、多底物酶促反应动力学均相酶催化反应:指酶与反应物系同处液相的酶催化反应.因此不存在相间的物质传递.均相酶催化反应动力学所描述的反应速率与反应物系的基本关系,反映了该反应过程的本征动力学关系,而且酶与反应物的反应是分子水平上的反应.一、酶促反应动力学基础影响酶促反应的因素：浓度：酶浓度底物浓度外部因素（环境因素）：溶液的介电常数与离子强度压力温度pH值内部因素（结构因素）：底物浓度及效应物酶结构产物浓度零级反应——酶促反应速率与底物浓度无关。max[]dSrdt式中：[S]——底物浓度；rmax——最大反应速率。（3-1）一级反应——酶促反应速率与底物浓度的一次方成正比。酶催化A→B的反应10()dbkabdt式中：——一级反应速率常数；——底物A的初始浓度；b——t时产物B的浓度。1k0a（3-2）二级反应——酶催化A+B→C的反应200()()dckacbcdt式中：——二级反应速率常数；——底物A和底物B的初始浓度；c——t时产物C的浓度。积分上式，得：2k00,ab0020000()1ln()backtababc（3-3）（3-4）连锁反应——酶催化A→B→C的反应1122dakadtdbkakbdtdckadt式中：——A，B，C的浓度；——各步反应的速率常数；12,kk,,abc（3-5）（3-6）2k1k（3-7）如果A的初始浓度为a0，B和C的初始浓度为0，并且a+b+c=a0，则可求得：112120102102121()[(1)(1)]ktktktktktaaekabeekkackekekk（3-8）（3-9）（3-10）二、单底物酶促反应动力学单底物酶促反应指一种反应物（底物）参与的不可逆反应。如：水解酶、异构酶和多数裂解酶催化的反应。1、米氏方程①Henri中间复合物学说②Michaelis-Menten方程③Briggs-Haldane方程④动力学特征（米氏方程的讨论）⑤动力学参数的求取①Henri中间复合物学说：式中：efree——游离酶；CS——底物浓度；C[ES]——酶-底物复合物浓度；CP——产物浓度；K+1——酶与底物形成复合物的反应速度常数；K-1——复合物解离为酶和底物的反应速度常数；K+2——ES复合物分解生成产物的反应速度常数。PEkk+1-1ES+2kES反应速率：单位时间、单位反应体系中某一组分的变化量来表示。对均相酶催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。反应速率为：1,SSdCrVdt1PPdCrVdt式中：rs—底物S的消耗速率，mol/(L.s);rP—产物P的生成速率，mol/(L.s);V—反应体系的体积，L；CS—底物S的物质的量，mol；CP—产物P的物质的量，mol；t—时间，s；根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：(3-11)式中：C[ES]—中间复合物[ES]的浓度，它为一难测定的未知量，因而不能用它来表示最终的速率方程。2PESrkC对上述反应机理，推导动力学方程时的三点假设：（1）在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即：CE0=CE+C[ES]。（2）与底物浓度CS相比，酶的浓度是很小的，因而可以忽略由于生成中间复合物[ES]而消耗的底物。（3）产物的浓度是很低的，因而产物的抑制作用可以忽略，也不必考虑P+E→[ES]这个逆反应的存在。据此假设所确定的方程仅适用于反应初始状态。②Michaelis-Menten方程推导过程：“快速平衡学说”（rapidequilirium）:假设：酶与底物反应生成复合物,和复合物又解离成酶和底物的反应之间快速建立平衡,而复合物解离成产物和酶,即ES→E+P是整个反应的限速步骤，即由酶和底物反应生成中间复合物的可逆反应在初速度测定时间内已经达到平衡。根据上述假设和式（3-11），有:][2ESSPPCkdtdCdtdCr和][11ESSECkCCk或表示为：SESSSESECCKCCkkC][][11式中：CE—游离酶的浓度，mol/L；CS—底物的浓度，mol/L;KS—解离常数，mol/L;反应体系中酶的总浓度CE0为：][0ESEECCC)1(][][][0SSESESSESSECKCCCCKC所以：即：SSSEESKCCCC0][SSSPSSSEPCKCrCKCCkrmax,20(3-12)式中：rP,max—产物的最大生成速率，mol/(L.s);CE0—酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，mol/L;式（3-12）即米氏方程，式中的两个动力学参数是KS和rP,max。其中：][11ESESSCCCkkKKS表示了酶与底物相互作用的特性。KS的单位和CS的单位相同，当rP=1/2rP,max时，存在KS=CS关系。rP,max=k+2CE0。表示当全部酶都呈复合物状态时的反应速率。k+2又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反应的分子数，因次，它表示酶催化反应能力的大小，不同的酶反应其值不同。rP,max正比于酶的初始浓度CE0。实际应用中将k+2和CE0合并应用为一个参数。③Briggs-Haldane方程1925年，Briggs和Haldane对米氏方程的推导作了一项很重要的修正。他们认为，当k+2＞k-1时米氏假设中的快速平衡（ripidequilibrium）不一定能够成立，所以，不能用上述“平衡学说”推导。即当从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。他们提出了“拟稳态”假设，认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随时间而变化。根据反应机理和上述假设，有下述方程式：][2ESPCkdtdC][11ESSESCkCCkdtdC0][2][11][ESESSEESCkCkCCkdtdC又因为有：][0ESEECCC所以：SSEESCkkkCCC121][0式中：Km—米氏常数，mol/L;Km与Ks的关系为：SmSPSSEPCKCrCkkkCCkrmax,12120(3-13)12121kkKkkkKSm(3-14)当k+2《k-1时，Km=Ks，即生成产物的速率大大慢于酶底物复合物解离的速率。Km值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条件有关。某些酶促反应的Km值：P30表3-1M-M方程与B-H方程比较见下表在M-M方程和B-H方程的推导中都假设CE0《CS0，因而C[ES]值也很小。如果酶的浓度很高，C[ES]值在反应过程中有可能是很高的。若仍然采用上述方程会带来较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为：][0ESEECCCPESSSCCCC][0][1][][1))((00ESPESSESESCkCCCCCkdtdC][21][][1][)())((00ESPESSESEESCkkCCCCCkdtdC][2ESPCkdtdC④动力学特征（米氏方程的讨论）根据米氏方程，酶反应的速度与底物浓度的关系为一双曲线，P30图3-1。该曲线表示了三个不同动力学特点的区域。当CS《Km，即底物浓度比Km值小很多时，该曲线近似为一直线。表示反应速率与底物浓度近似成正比关系，此时酶催化反应成为一级反应速率方程。SmSSKCKCrrmax当Km值很大时，大部分酶为游离态的酶，而C[ES]的量很少。要想提高反应速率，只有通过提高CS值，进而提高C[ES]，才能使反应速率加快。因而此时反应速率主要取决于底物浓度的变化。将上式进行重排，积分，可以推出SSmCCKtr0lnmax(3-15)式中：CS0—底物的初始浓度，mol/L;这个原理在酶法分析中被应用。利用酶测定底物时，可使用足够量的酶以便在较短时间内，使反应达到完全。这样测定形成的产物总量就与待测物的量相等或相关。tKrCCmSSmaxexp0当CS》Km时，该曲线近似为一水平线，表示当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。此时酶反应可视为零级反应，反应速率将不随底物浓度的变化而变化。这是因为当Km值很小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游离的酶很少，因而即使提高底物的浓度，也不能提高其反应速率。maxrrS(3-16)SSCCtr0maxtrCCSSmax0即：或：当CS与Km的数量关系处于上述两者之间的范围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在t=0时，CS=CS0，对（2-13）式积分得到：SSmSSCCKCCtr00ln)(maxSmSSXKXCtr11ln0max或：式中：00SSSSCCCX，XS为底物转化率。Levenspiel提出亦可用幂函数形式表示米氏方程，为：SmmCKKSSCrrmax总结：M-M方程平衡假设：游离态酶浓度复合态酶浓度sSSESEESESSESEESSEKCCkkCCCCkCCCkCkCCk11111100B-H方程拟稳态假设：游离态酶浓度复合态酶浓度mSSESEESESSESEESESSESEKCCkkkCCCkkCCCCkCKCkCCCk211211211000)()(0)(⑤动力学参数的求取将米氏方程线性化，用作图法求取动力学参数rmax（或k+2）和Km值。A、Lineweaker-Burk法（L-B法）B、Hanes-Woolf法（H-W法）C、Eadie-Hofstee法（E-H法）D、积分法A、Lineweaker-Burk法（L-B法）将米氏方程取倒数，得到：SmSCrKrr111maxmax以1/rs对1/CS作图得一直线，斜率为Km/rmax，直线与纵轴交于1/rmax，与横轴交于-1/Km。此法称双倒数图解法。见图2-2（a）。B、Hanes-Woolf法（H-W法）上式两边均乘以CS，得到：maxSmaxmSSrCrKrC以CS/rS对CS作图，得一直线，斜率为1/rmax，直线与纵轴交点为Km/rmax，与横轴交点为-Km。见图2-2（b）。C、Eadie-Hofstee法（E-H法）将米氏方程重排为：SSmSCrKrrmax以rS对rS/CS作图，得一直线，斜率为-Km，与纵轴交点为rmax，与横轴交点为rmax/Km。见图2-2（c）D、积分法将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入米氏方程的积分形式，经整理得到：mSSmSSSSKCCtKrCCCC1ln000maxSSSSCCCC00ln与SSCCt0对