中药化学成分提取分离方法--中国中医科学院中药所 边宝林

中药化学成分提取分离方法中国中医科学院中药所边宝林日本学者：（长井长义）•天然药物化学研究定义：•1、将药品（生药）改变成为利于人体吸•收的形式。•2、对有效成分不明的草根、树皮进行分•析，明确有效成分。•3、通过成分的改造、合成、创造新药。中药有效成分的研究•基于以上内容，突出中医用药理论，继承、发扬中医药宝库，造福人类。1、已有数千年的用药史（经验和理论）2、饮片用药的特点CH2OHO-β-GLCOOOOCH3CH3CH3O1.揭示中药有效性的物质基础Salicin（柳の皮）Khellin、Ammi、visnaga（セリ科）解热冠脉扩张作用morphine镇痛剂ergotamine麦角アルヵロィドOCH3HOHONHNHCONHCH3NNOOHH3CHOHCH22、开发新药的有效途径之一生物测定法策划信息植物、动物、微生物等药材的保证分子水平酶水平器官、组织、细胞水平整体动物病态模型动物提取粗分离筛选细分离、精制构造研究合成应用开发译价医药品药物设计中药设计一类、（单位成分）二类、（有效成分群）3、控制中药材质量标准的手段之一中药材GAP中药饮片GMP提取（煎煮）制剂GCP临床中药有效成分的分离、分析是监控药材栽培、炮制工艺、制剂生产和产品贮藏、销售的重要手段。中药化学成分提取分离方法•常用化学成分提取分离方法•大孔吸附树脂分离有效成分的应用•分离实例一、有效成分的提取㈠溶剂提取法㈡水蒸气蒸馏法㈢升华法㈣超临界流体萃取法㈤其他方法㈠溶剂提取法•溶剂提取法系选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。遵循“相似相溶”规律。•天然药物中的化学成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一些常见溶剂的脂性的强弱顺序如下：石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水•天然药物化学成分可通过结构估计它们的极性。㈠溶剂提取法•甙类的分子中结合有糖分子，羟基数目多，能表现强亲水性，而甙元则属于亲脂性化合物，而生物碱盐，能够离子化，加大了极性，就变成了亲水性化合物。鞣质是多羟基衍生物，列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性成分。•萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性较小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；•糖苷、氨基酸等成分极性较大，易溶于水及含水醇中；•酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）随溶液而异，故溶解度将随pH而改变。㈡水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。天然药物中的挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏法。㈢升华法某些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体称为升华。天然药物中有一些成分具有升华性质，能利用升华法直接中药材中提取出来。但天然药物成分一般可升华的很少。㈣超临界流体萃取法•超临界萃取法是一种集提取和分离于一体，又基本上不用有机溶剂的新技术。•超临界流体是处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，介于气体和液体之间的流体。这种流体同时具有液体和气体的双重特性。•可以作为超临界流体的物质：CO2、NH3、C2H6、CCL2F2、C7H16等，实际应用CO2较多。㈣超临界流体萃取法•CO2超临界流体对物质溶解作用有一定选择性，主要与物质的极性、沸点、分子量相关密切。极性较低的化合物易萃取，化合物极性基团多，萃取较难。对此，近年来采用再超临界流体萃取中加入夹带剂的方法。•夹带剂是在被萃取溶质和超临界流体组成的二元系统中加入的第三组分，从而改善原来溶质的溶解度。常用的夹带剂：甲醇、乙醇、丙酮等㈣超临界流体萃取法超临界流体萃取中药成分的主要优点：⑴可以在接近室温下进行工作，防止某些对热不稳定的成分被破坏或逸散。如：通过对丹参超临界萃取物的高效液相色谱法分析表明，丹参酮ⅡA含量为43.55%，以丹参酮为3.29%，丹参酮Ⅰ为7.60%，与普通方法相比总丹参酮类成分得到较好富集；再有人对丹参中活性成分的超临界二氧化碳萃取工艺进行研究，现已第1夹带剂进行萃取得丹参酮类活性部位，再用第2夹带剂继续萃取，得丹参素和原儿茶醛等酚酸类有效成分。⑵萃取过程中几乎不用有机溶剂，萃取物中无有机物溶剂残留，对环境无公害⑶提取效率高，节约能耗等㈤其他方法组织破碎法某些对热不稳定成分又可溶于水时，可用组织破碎提取法压榨法某些成分在新鲜原料中含量较高或新鲜原料富含肉质可用压榨法微波提取法二、有效成分的分离与精制化学成分分离精制常用方法原理㈠根据物质溶解度差别进行分离㈡根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离（逆流色谱技术）㈢根据物质的吸附性差别进行分离（ODS与大孔吸附树脂技术）㈣根据物质分子大小差异进行分离（膜分离与凝胶技术）㈠根据物质溶解度差别进行分离1、利用温度不同引起溶解度的改变2、改变混合溶剂的极性3、调节溶液的pH值，改变分子的存在状态4、沉淀法5、盐析法㈡根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离•分配系数（K）两种相互不能任意混溶的溶剂（如氯仿与水）如置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时如果其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中的分配比（K）在一定温度及压力下为一常数，可以下式表示：K=CU/CL•K：分配系数；CU：溶质在上相溶剂中的浓度；CL：溶质在下相溶剂中的浓度。㈡根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离1、液-液萃取法2、逆流连续萃取法3、逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）4、液滴逆流色谱法（DCCC）5、高速逆流色谱法（HSCCC）6、气液分配色谱（GC或GLC）7、液-液分配色谱（LC或LLC）1、液-液萃取法•利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。•萃取时如果各成分的分配系数相差越大，分离效率越高。•水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成分是偏于亲水性的物质，需用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。•提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。2、高速逆流色谱(High-speedCountercurrentChromatography，HSCCC)•大多数色谱法都需要有固相载体某种形式的选择性吸附作用。在应用固相载体色谱分离中，往往会存在不同程度的不可逆吸附，造成被分离样品的损失，尤其在分离微量样品时受到限制。•高速逆流色谱，是近十年迅速发展起来的新型液—液分配色谱技术。与其它液相色谱分离方法相比．它不使用固相载体作固定相，被分离物质在互不相溶两相分配分离，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。且花费溶剂少，分辨率高，可进行纯品制备。利用HSCCC，中草药粗提物的分离纯化制备可同步完成，被分离物可定量回收。HSCCC的应用1.HSCCC的分离效率与气相色谱和高效液相色谱等技术相比较，前者不适宜用它完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而其对于样品的预处理条件较放松及回收率高，制备量大，特别适用于特定部位和特定组分的分离纯化与制备。HSCCC的应用2.制备中药化学对照品3.中草药化学对照品应具有高度均匀性，量值准确性和良好稳定性，其纯度要求很高。制备型HPLC曾是国外常用的主要手段。但是其设备和载体填料价格很高．对样品前期处理要求严格，存在不可逆吸附，溶剂用量大的缺点。因此致力于HSCCC分离、统化、制备中草药有效成分对照品的研究和产业化，具有现实意义。3、高效液相色谱(HPLC)中药的成分非常复杂，以往常用的薄层色谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不能满足中药现代化发展的需要。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最重要的分析方法。中药质量的控制、天然药物化学成分的分离及分析测定等。3、高效液相色谱(HPLC)•检测器是液相色谱的三大关键部件（高压输液泵、高效色谱柱和检测器）之一。其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步。理想的检测器应具有以下特点：⑴灵敏度高；⑵对温度变化和流量波动不敏感；⑶死体积小，不使峰额外地扩展；⑷对溶剂无响应，能用于梯度洗脱操作⑸线性范围宽；⑹对所有样品都有响应；⑺对样品无破坏性。常用的HPLC检测器（1）紫外-可见分光检测器（2）示差折光检测器（3）二极管阵列检测器（4）蒸发光检测器（5）质谱检测器（6）C、H核磁检测器高效液相色谱的应用•中药化学成分分析•成分分离制备(1)特别适用于极性较大的成分(如皂苷类)分离；(2)先以分析色谱摸索分离条件；(3)样品一定要用流动相溶解，再以滤膜过滤。㈢根据物质的吸附性差别进行分离•在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固-液吸附用得最多，其分：•物理吸附(表面吸附，physicaladsorption)：以硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂•化学吸附（chemicaladsorption）•半化学吸附（semichemicaladsorption）：聚酰胺层析1、物理吸附•液-固物理吸附色谱是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分。一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等的分离。•吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。⑴吸附剂①硅胶②氧化铝③活性炭吸附剂的特点•硅胶和氧化铝为极性吸附剂，有以下特点：①对极性物质具有较强的亲和能力。故同为溶质，极性强者将被优先吸附。②溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。③溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。吸附剂的特点•活性炭因为是非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对该类物质表现出强的吸附能力。•溶剂极性降低，则活性炭对该类物质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的减弱而增强。⑵溶剂•洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑。在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。⑶被分离物质的性质•被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附性强。2、吸附薄层色谱•薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时，即称薄层层析。（硅胶、聚酰胺等）•针对某些性质特殊的化合物的分离与检出，有时需采用一些特殊薄层。特殊薄层①荧光薄层②络合薄层③酸碱薄层和PH缓冲薄层薄层层析法应用①化学成分的预试②化学成分的鉴定③探索柱层分离的条件3、吸附柱色谱（柱层析）⑴吸附剂的用量•一般为样品量的30～60倍。样品极性较小、难以分离者，吸附剂用量可适当提高到样品量的100～200倍。据此可选择适当规格的色谱管，实验室中常用色谱管的规格如下所示，其高度与直径比（h/d）约为（15∶1）～（20：1）。•柱色谱用的硅胶及氧化铝通常以100～200目或200～300目为宜，或甚至直接采用薄层色谱用规格，其分离效果可以大大提高。3、吸附柱色谱⑵洗脱剂的选择，以TLC摸索洗脱条件装柱，湿法装柱（以起始洗脱剂拌匀装柱）或干法装柱。3、吸附柱色谱（3）样品的预处理•能直接溶于洗脱剂的样品用适量洗脱剂溶解样品，尽可能少，以利样品在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。•不