丝素蛋白文献阅读笔记20130506

丝素蛋白一、丝素蛋白的结构基础二、丝素蛋白的特点三、丝素蛋白的获取四、丝素蛋白的应用文献一《丝素蛋白作为生物材料的基础研究》蚕丝中的丝素蛋白作为纯天然生物高分子材料用于医用领域已经有很长历史,而将其用于细胞培养的基质和组织工程,是近年来丝素蛋白研究与应用的热点。丝素蛋白完全可以用作细胞生长的表面基质,可替代常用的胶原蛋白。本文尝试应用丝素薄膜作为贴壁依赖型动物细胞的生长表面基质,以研究丝素薄膜作为生物材料在细胞培养上的特性。实验中以猪髋动脉内皮细胞(Porcineiliacarteryendothelialcell,简称PIEC)为模型细胞,同时用酸性成纤维生长因子(aFGF)对丝素薄膜进行处理,以噻唑蓝(MTT)法的细胞计数测定方法,通过与普通培养孔板上的对照实验,观察此细胞株在丝素薄膜表面的粘附与生长等行为,从而检验丝素薄膜的生物相容性,并确定丝素薄膜经aFGF处理后对细胞吸附能力的强化。丝素薄膜的制备:将去蛹蚕茧放入煮沸的5g/L的Na2CO3溶液中,固液比为1∶15(g∶mL),煮沸时间为40min,反复2次,以脱除蚕丝中的丝胶蛋白。煮沸后的丝素蛋白固形物用去离子水反复洗净,在真空干燥箱中20°C干燥24h。所得的丝素蛋白固形物放入500g/L的CaCl2溶液中,固液比为1∶10,煮沸直至丝素蛋白完全溶解(15～30min)。将所得丝素2CaCl2溶液抽滤去除杂质,其滤液在透析膜中不断用去离子水透析2～3d以完全去除CaCl2,得纯净的丝素蛋白溶液。经SDS2PAGE凝胶电泳实验测得,丝素蛋白在溶液中为相对分子质量分布于43000～331131u的连续体系。配制蛋白质浓度为5～15mgömL的丝素蛋白溶液,用移液器注入24孔孔板中,在烘箱中40°C干燥24h以形成薄膜。细胞培养实验前,将U=0.8的酒精注满含有丝素薄膜的孔板或培养孔底部,紫外照射30min以上,以对丝素薄膜进行灭菌。然后在无菌条件下倾倒出酒精,用灭过菌的磷酸缓冲液反复润洗含有丝素薄膜的孔板,以消除酒精对细胞生长的抑制作用。丝素薄膜的酸性成纤维细胞生长因子溶液处理:接种前,用含10%小牛血清的DMEM培养基配置一定浓度的aFGF溶液,无菌条件下用其浸润丝素薄膜24～48h,细胞接种前倾倒尽aFGF溶液。文献2《蚕丝素蛋白及其应用——阐述了丝素蛋白的组成、结构、性质和制备方法,及其综合利用现状》蚕丝由2种蛋白组成,包围在蚕丝外层的是丝胶蛋白,内层为丝素蛋白。不同种类的蚕丝中,丝素蛋白的含量不尽相同,但大体上说,丝素蛋白占蚕丝总质量的70%~80%。组成和结构1.1
组成丝素蛋白由18种氨基酸组成,其中有8种是人体所必需的氨基酸。由于种类的不同,柞蚕丝和桑蚕丝的丝素蛋白中氨基酸含量具有明显的差别,详见表1。除了碳、氢和氮元素外,丝素蛋白还含有多种其他元素如钾、钙、硅、锶、磷、铁、铜等,这些元素与丝素蛋白的性能及蚕吐丝的机理等有直接关系。1.2
结构丝素蛋白是一种纤维状蛋白,由表层的无定形区和里层的结晶区构成。其中结晶区包括2种结晶形态,分别称为silkI型和silkII型。在silkII中,肽链的链段排列整齐,相邻链段之间的氢键和分子间引力使它们结合的相当紧密,抵抗外力拉伸的能力强,柔软度低,在水中难以溶解,对酸、碱、盐、酶及热的抵抗力较强。无定形丝素中肽链的链段排列不整齐,链段之间的结合力较弱,易溶于水,柔软度高,抵抗外力拉伸的能力弱,吸湿性强,对酸、碱、盐、酶和热的抵抗力较弱。在透射电镜和扫描电镜下观察,丝素纤维的最基本结构单元是直径为10~50nm的微原纤,微原纤聚集成数万纳米的原纤,大约100根原纤再集合成十万纳米数量级的巨原纤,巨原纤再聚集成几百万纳米的丝素纤维。桑蚕丝素蛋白的氨基酸序列已经确定。桑蚕丝素分子羧基末端的非重复区域含有较多的碱性氨基酸,尤其是精氨酸。而柞蚕丝素不仅含有碱性氨基酸,还含有作为细胞粘附座而闻名的三肽序列:精氨酸-
甘氨酸-
天门冬氨酸。2
性质丝素蛋白具有多孔性和较高的吸水回潮率,不溶于水,可溶于高浓度的某些无机盐。丝素蛋白在100℃时开始脱水,从175℃开始逐步失重,颜色由白变黄,至280℃完全变黑,305℃时分解。丝素蛋白分子中因含酚羟基及其他结构,易吸收紫外光而变性。随着照射时间的增加,丝素蛋白泛黄程度也增加,特别是在有水的环境下,泛黄程度加剧。丝素溶液中丝素蛋白的构象为无规则卷曲结构,在45℃下中速干燥固化得到含silk#结构的丝素膜;温度高于45℃时,silkI向silkII转变。丝素溶液干燥固化后的结构不但受温度影响,还与干燥速度、溶液的酸碱度及组成有着密切的关系。长时间常温下干燥的过程中有silkI的形成,但最终会形成稳定的silkII;当干燥速度过快时,即使在50℃以上,仍以无定形结构为主;若溶液干燥初期pH值大于5,则形成无定形结构;若溶液干燥初期pH值小于5,则形成silk∃;若丝素水溶液中加入甲醇、乙醇等溶剂,则形成silkII;另外,将丝素水溶液搅拌或将固态丝素快速拉伸,则形成silkII;将丝素水溶液放置于7kV的电场中时,部分带极性的链段在电场的作用下定向排列,使丝素构象形成silkII。由此我们可以看出,丝素溶液在受到外界刺激时,很容易形成其比较稳定的结构形态silkII。有些金属离子对丝素蛋白的构象有一定的影响。在一定pH值条件下,Ni2+离子通过四配位的螯合作用诱导丝素蛋白silkII的形成;Viney根据电感耦合等离子体(ICP)技术推测Ca2+的增加能使silkII的形成加速;李贵阳等用NMR谱定量拟合的结果表明,Ca2+、Cu2+的存在有利于silkII的形成;PaolaTaddei发现Co2+的配位作用也对丝素蛋白的结构有着一定的影响.3
制备提取丝素蛋白的途径主要有2种:从五龄蚕的丝腺中直接获得丝素蛋白;从天然蚕丝或茧壳中提取丝素蛋白。由于从蚕的丝腺中提取丝素蛋白的操作难度比较大,所以在需要大量制备丝素蛋白的情况下,人们多数采用第二种方法,即从天然蚕丝中提取丝素蛋白。从天然蚕丝或茧壳中提取丝素蛋白分为2个步骤:蚕丝或茧壳的脱胶和丝素纤维的溶解。3.1
脱胶(1)马赛热皂液法(Marseillessoap)(2)Na2CO3脱胶法；(3)酶解脱胶法(4)尿素脱胶法(5)皂液脱胶法(6)水脱胶法3.2
丝素纤维的溶解(1)Ajisawa's法;(2)LiBr溶解法;(3)LiSCN溶解法;(4)Ca(NO3)2溶解法;4
应用丝素蛋白的应用非常广泛,本文按照其作用机理把丝素蛋白的应用领域分为2大类:生物材料和生物医学。4.1
生物材料(1)酶的固定化载体酶的固定化是指通过物理或化学方法将酶固定在某种载体上(此时的酶或酶的衍生物仍具有很高的催化活性)。与游离酶相比,固定化的酶对热、酸、碱的稳定性得到了相应的提高,而且能轻易与底物和反应物分开、回收并反复利用。丝素蛋白是天然的高分子蛋白,具有独特的分子结构、优异的机械性能、良好的吸湿和保温性能、以及抗微生物性能,是一种理想的酶固定化载体材料。以丝素蛋白作为固定化载体的形式有3种:丝素纤维固定化载体、丝素粉末固定化载体和丝素膜固定化载体。(2)生物传感器将生物活性物质材料用做敏感元件,配以适当的换能器构成的分析系统称为生物传感器。其原理为:待测物质经扩散作用进入固定化生物敏感膜,经过分子识别,发生生物学反应,产生的信息被相应的化学或物理换能器转变成可定量处理的电信号,再经二次仪表放大输出从而获得待测物质含量的信息。生物传感器中研究和应用最多的是酶传感器。丝素膜是一种优良的酶固定剂,它的优点在于不需要任何交联剂,只需通过物理作用和化学处理,如改变温度、pH值、溶剂、拉伸等就可以完成。因此,它减少了酶的失活,扩大了酶活性的pH值范围,提高了酶的利用效率,且丝素膜对大多数溶剂都相当稳定,具有一定的强度和弹性。除了酶传感器外,丝素蛋白膜还可用于免疫传感器和神经传感器。(3)组织工程支撑材料组织工程是将组织细胞粘附在一种生物相容性良好,可在人体内逐步被降解吸收的支架材料上,并提供营养使之扩增,在体外形成细胞——生物材料复合物,然后将这种复合物植入肌体内,在支架材料逐步被人体降解吸收的同时,细胞不断增殖并分泌基质,最终形成具有与原来特殊功能和形态相应的组织和器官,从而达到修复创伤和重建功能的目的。组织工程中支架的材料必须符合以下基本要求:具有足够的机械强度以支持细胞分化增生;材料来源充足,易于重复制作、加工成型;良好的生物相容性,其本身及降解产物对细胞和肌体无毒性,不会或较少引起炎症和免疫排斥反应;有适度的生物降解速率,且该降解速率需和组织再生的速率相匹配,最后可被完全吸收或安全排出体外;良好的表面相容性,即材料表面具有足够的细胞吸附能力,有利于细胞的粘附和生长。丝素蛋白正是由于比较符合上述性质要求,在生物材料领域得到了日益广泛的应用。而将其用于细胞培养的基质,或对一些生物高分子进行修饰,改善他们的生物性能,使其适用于组织工程,更是近年来丝素蛋白应用研究的热点。人们更希望将天然生物大分子与合成高分子结合起来,从而得到性能优异的支架材料,以满足在组织工程中对支架材料的多方面性能要求。近年有人把丝素蛋白用做透析膜和隐形眼镜的材料。4.2
生物医学(1)人工器官或组织丝素制造人工器官的热点主要集中在人造皮肤上。已有暂时性皮肤替代物应用于烧伤的临床治疗,其透明性使观察创面的情况较为容易,创面的痛感较弱,丝素膜与创口结合紧密,不易融化,可防止感染,保持良好的透气性,再加上丝素对皮肤细胞的生长促进功能,使其愈创效果更显突出。目前,有人正在研制含抗菌药物的丝素膜,其不仅具有丝素创面保护膜优良的物理、化学和生物学性能,还具有良好的杀菌作用,可作为一种抗感染的创面覆盖材料应用。由于蚕丝的强度和弹性系数与生物体的肌腱有近似的数值,具有良好的生物亲和性,因此,有学者开展了人工肌腱与韧带方面的研究。在绢丝中导入带电化合物,改质后的丝素钙的凝集量比无处理的绢丝有大幅度的增加,特别是导入磷酸基的绢丝中,钙的凝聚量比无处理的绢丝高10倍以上,可望用于开发人工肌腱与人工韧带。(2)抗凝血活性动物内脏中肝磷脂具有较强的抗凝血活性,是一种硫化多糖,其分子中的硫酸基对凝血活性起重要作用。当丝素中导入硫酸基时同样能表现出抗凝血活性。在进一步研究中,使用氯化硫酸来代替浓硫酸,得到的抗血液凝固活性提高约100倍,活性达到肝细胞的20%左右。由于这种物质可低价制造,不仅可作为防止血液凝固的试用药,也可用于提高人工血液的抗凝固机能,目前已有人开发出此类抗凝血药。(3)化妆品丝素蛋白具有天然的护肤美容效果。先从其氨基酸组成来看,丝素蛋白含量最高的几种氨基酸恰恰是皮肤胶原蛋白的主要成分,它与皮肤有很好的亲和性,极易被皮肤吸收,可视为能被皮肤直接−食用.的营养物质;同时,丝素蛋白中含有大量的亲水基团(如:-OH、-COOH、-NH2等),可发挥天然保湿因子的作用;最后,丝素蛋白中含有相当数量的酚羟基,具有吸收紫外线、抗氧化和防止或减缓皮肤黑色素形成的作用。(4)药物的控释材料丝素蛋白可以作为药物的控释材料,增强或减缓药物在体内的作用时间和效力。闵思佳等在丝素蛋白用于药物载体方面的研究表明,丝素凝胶具有一定药物透过性,在释放药物时,具有一定程度的pH值响应性和酶分解性。5
展望目前,人们对丝素蛋白的研究和利用还非常有限,如在组织工程方面,把丝素蛋白作为支撑材料的研究才刚刚起步,其稳定性还有待进一步研究;在医学方面,用丝素蛋白制作人工器官和人工组织也只是初级阶段;即便是已有大量产品正在销售的化妆品方面,某些作用机理也没有十分明确。因此在丝素蛋白质应用开发方面的研究还任重道远。丝素蛋白的氨基酸组成特殊,虽然不同种类蚕的氨基酸组成存在着较大的差异,但其中的甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸和丙氨酸这4种氨基酸的质量分数均高达85%左右。而这几种氨基酸都具有自己独特的生理功能,如甘氨酸具有降低血液中胆固醇浓度的作用;丝氨酸和甘氨酸都具有解毒保肝的功效;丙氨酸具有解酒功能;酪氨酸具有预防痴呆症的作用