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mtDNA提取流程(1)将待测组织充分切碎(碎片大小:脾脏组织≤10mg、其他组织≤25mg),取样品25mg移入微型离心管。(2)加入180μLBufferATL、20μLProteinaseK、缓慢充分混匀,置于56℃恒温水浴直到完全溶解(水浴期间间隔摇晃混合)。在开始下一步前摇晃混合15s。(3)加入200μLBufferAL,充分混合(血液样品需56℃恒温水浴10min)。(4)加入200μL无水乙醇,混合均匀。(5)将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里,6000xg条件离心1min,取出滤管,扔掉收集管。(6)将滤管放入新的收集管中,加入500μLBufferAW1,6000xg条件离心1min,取出滤管,扔掉收集管。(7)将滤管放入新的收集管中,加入500μLBufferAW2,20000xg条件离心3min,取出滤管,扔掉收集管。(8)将滤管放入新的微型离心管(1.5-2mL)。(9)向滤管中心滴加200μL(100μL)BufferAE洗涤DNA,室温放置1min。6000xg条件离心1min。(10)重复一边上述步骤,增大DNA产率(重复一遍即可)。理论25mg原料大概能提取10-20μgDNA.注:摇晃混合和拿起时一定要轻慢,防止DNA断裂。琼脂糖电泳步骤1.准备电泳槽:将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干,插上样品梳。2.琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中(1%的琼脂糖含量),置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。3.灌胶:将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上(厚度不超过0.5cm)。待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。5.加样:将DNA样品与加样缓冲液按5:1混匀后(取10µLDNA样液与2µL电泳载样缓或5µLDNA样液与1µL电泳载样缓冲液混匀,用移液枪将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μL,记录样品的点样次序和加样量。6.电泳:安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至80V(4V·cm-1),电泳2h,当移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。7.染色和观察:取出凝胶,放在260nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。短期贮存:4℃或-20℃存放于TE(Tris和EDTA)缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关,PH为8时,可减少DNA脱氨反应,PH低于7.0时DNA容易变性。长期贮存:TE缓冲液中-70℃保存数年;在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。
本文标题:线粒体DNA提取
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