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RT-PCR技术背景基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物变性退火延伸RT-PCR技术目的通过反转录(reversetranscription,RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的方法,检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度RT-PCR实验原理m-RNAc-DNAPCR产物RT(反转录)PCR这里修改标题RT-PCR实验原理RT-PCR实验步骤——提取总RNATRIzol法抽提总RNA1、细胞1×107或组织100mg,加1mlTRIzol(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底,后转至EP管)颠倒混匀10下,室温5分钟。2、氯仿1/5体积(0.2ml),颠倒混匀10下,室温5分钟。3、4℃,离心12000g,15分钟。4、转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中,加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟。5、4℃,离心12000g,10分钟。6、弃上清,加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml。7、4℃离心7500g,5分钟。8、弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥),溶于DEPC水中至20μl(可在55-60℃水中,10分钟助溶)。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。RT-PCR实验步骤——反转录(RT)逆转录反应:1、RNA1-5μg,加入适量的DEPC水至11μlOligo(dT)151μl混匀,离心,70℃10min。2、立即冰水浴。10XPCRbuffer2μl25mMMgCl22μl10mMdNTPmix1μl0.1MDTT2μL混匀,离心,42℃50min。3、95℃10min(破坏MLV,终止反应),4℃保存。RT-PCR实验步骤——聚合酶链反应(PCR)PCR反应:反应体系:总体积20μl(50μl)试剂浓度体积TaqBuffer10×(5μl_)dNTP10mM(0.5μl)上游引物10pmol/μl(1μl)下游引物10pmol/μl(1μl)cDNA模板(1-10μl)Taq酶2.5U/μl(1μl)DEPC水20μl-4.3μl混匀28-36循环,4℃保温RT-PCR实验步骤——琼脂糖凝胶电泳加1-10μlPCR产物与上样缓冲液(1-2.5μl)混匀,加样,电泳。成像系统进行成像分析。琼脂糖凝胶电泳结果分析DNA分子中含有磷酸基和碱基,在生理条件下,磷酸基中的羟基发生解离,因此DNA带负电在电场中向正极移动。数量分析:条带的宽度、荧光的亮度质量分析:纯度,分子量琼脂糖凝胶电泳结果分析
本文标题:分子生物学RTPCR
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