WB实验技术手册

前言WesternBlot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，昀后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待测标本中的表达情况。目前WesternBlot已经是蛋白检测的昀常用和成熟的技术之一。要成功完成WesternBlot检测，必须满足4个条件：1.凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析2.吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析3.处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上4.处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WesternBlot检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WesternBlot的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：•阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率•阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性•二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性•内参对照：检测标本的质量和二抗系统•空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果本手册从按照WesternBlot操作的基本过程来解析一些主要的要点和注意事项、常见问题分析，旨在能为各位老师在进行实验时提供点滴参考。２洗膜二抗孵育蛋白定量、煮沸处理上样、电泳转膜封闭洗膜曝光或者显色一抗孵育洗膜底物孵育细胞/组织蛋白提取我要抗体51AB51AB无忧抗体３WB第1步：组织或细胞蛋白提取、样本处理一、蛋白提取蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：蛋白位置推荐buffer全细胞NP-40或RIPA胞浆（可溶性蛋白）Tris-HCl胞浆（骨架结合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取试剂盒线粒体蛋白RIPAor线粒体分离试剂盒线粒体/细胞浆蛋白分离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳动物细胞（包括凋亡和非凋亡细胞）中分离出线粒体部分和胞浆部分，得到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和线粒体中分布的变化，如：WB，ELISA等。操作过程简单、方便，不使用有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构。相关产品信息目录号产品描述规格价格ab65320Mitochondria/CytosolFractionationKit100test4272我要抗体51AB51AB无忧抗体021-61130227/8/9４2、选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！抑制剂名称作用蛋白酶/磷酸酶名称终浓度储存液(保存在-20℃)Aprotinin胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶2μg/ml用水溶解,10mg/ml不可反复冻融Leupeptin溶酶体酶5-10μg/ml用水溶解。不可反复冻融。PepstatinA天冬氨酸蛋白酶1μg/ml用甲醇溶解,1mM。PMSF丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶1mM用乙醇溶解。分装管可反复使用。EDTA需要Mg2+和Mn2+的金属蛋白酶5mM用蒸馏水溶解0.5M调整pH值到8.0EGTA需要Ca2+的金属蛋白酶1mM用蒸馏水溶解0.5M调整pH值到8.0NaFluoride丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5-10mM用水溶解。不可反复冻融。NaOrthovanadate酪氨酸磷酸酶1mM用水溶解。不可反复冻融。Sodiumorthovanadate制备:用双蒸水制备100mM的溶液；用HCl调整pH值到9.0，然后煮沸到溶液无色，冷却到室温；再次调整pH值到9.0，再煮沸到溶液无色。如此反复调整煮沸直到pH值维持在9.0不再变化。用双蒸水调整到初始体积。分装然后保存在-20°C注意：在煮沸过程中液体体积避免变化太大，可加瓶盖以免溶液过渡蒸发。需在通风橱中操作。溶液变黄后即丢弃。相关产品信息目录号产品描述规格价格ab65621ProteaseInhibitorCocktail(Aprotinin,Leupeptin,PepstatinA,PMSF)500test2160我要抗体51AB51AB无忧抗体５3、在检测时使用内参抗体，以检测蛋白提取的质量4、提取蛋白后进行蛋白的定量，以对后续操作进行监控（比如半定量，确定蛋白上样量等）蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。也有市售的商业化的蛋白定量试剂盒，可直接购买使用。二、样品处理（提取后蛋白处理）1、变性、还原标本：在标本中加入含有SDS的上样缓冲液，然后在95-100℃煮沸5-15分钟，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有时也可以在70°C加热5-10分钟，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率）。标准的上样缓冲液是2XLaemmlibuffer，有时为了减少标本的稀释比例，也可以制备4X和6X的上样缓冲液。如果使用2X缓冲液，则缓冲液和标本的比例为1:1。在加热/煮沸前后，均需要充分漩涡混匀标本。上样量：一般为20-40ug，根据样本中待测蛋白的表达水平，做出合适的优化。上样量过多会出现非特异性染色；过少则会导致检测不到出现假阴性的结果。Laemmli2Xbuffer的配方：4%SDS10%2-mercaptoehtanol20%glycerol0.004%bromophenolblue0.125MTrisHCl我要抗体51AB51AB无忧抗体021-61130227/8/9６调整pH值到6.82、天然和非还原标本：有些抗体识别的表位是非连续氨基酸，这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续，但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识别靶蛋白的空间结构状态（一般在抗体的说明书中都会有特殊说明）。对于这类抗体检测的标本，只需要在缓冲液和凝胶中去除SDS即可，并且不能对蛋白进行加热变性。而有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态，对此类标本，就需要将缓冲液和凝胶中的还原剂DTT和β-巯基乙醇去除。先根据待测蛋白状态确定电泳条件：待测蛋白状态凝胶条件上样buffer电泳bufferReduced-Denatured还原，变性含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSReduced-Native还原，不变性含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDSOxidized-Denatured不还原，变性不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSOxidized-Native不还原，不变性不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDS备注：除非说明书有特殊说明，一般WB均为变性和还原电泳条件。我要抗体51AB51AB无忧抗体７WB第2步：PAGE电泳分离蛋白和转膜、封闭一、电泳分离制备凝胶SDS-PAGE凝胶可以购买商业化的也可以自行配制，不论选择哪种，确定合适的凝胶浓度是十分关键的。凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量大小，目的蛋白分子量越大，则凝胶浓度越低。参阅下表根据待测蛋白分子量大小确定分离胶的浓度蛋白分子量（kDa）凝胶（分离胶）浓度（％）4-402012-451510-7012.515-1001025-2008选择合适的阳性对照：阳性对照为已经明确表达目的蛋白的细胞或组织提取物，同时电泳，杂交，以确定检测结果的准确性以及判定抗体的有效性。Abcam抗体说明书中一般有推荐的阳性对照类型，同时Abcam还提供大量的细胞和组织裂解物，可用作WB的阳性对照。蛋白质分子量Marker蛋白质分子量Marker的使用，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！预染Marker更方便直接观察电泳和转膜效果。相关产品信息目录号产品描述规格价格分子量范围ab41746proteinMolecularWeightMarker500ul186014.6-112kDaab48854proteinMolecularWeightMarker500ul18608.5-70kDa我要抗体51AB51AB无忧抗体021-61130227/8/9８上样与电泳将处理后的标本直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，通常选择蛋白质分子量Marker（市售有不同大小的预染和非预染蛋白Marker）。电泳时间：通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。二、转膜杂交膜是WB进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个WB的实验是非常重要和关键的。可以根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率昀高。各种膜的技术参数及比较如下：PVDF膜NC膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高背景低低较高蛋白结合能力100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）80-100ug/cm2400ug/cm2机械强度强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强差差使用前是否需要浸润100%甲醛润湿缓冲液润湿缓冲液润湿适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁不能用阴离子染料适用检测方法显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测显色法、化学发光、荧光、放射性显色、化学发光、放射性适用范围普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋普通蛋白WB、氨低浓度小分子我要抗体51AB51AB无忧抗体９PVDF膜NC膜尼龙膜白质测序、氨基酸分析、重复检测基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用价格高较低低备注：PVDF膜需要小心预处理：将膜剪成合适的大小，在甲醇中浸润1-2分钟后，在预冷的转膜buffer中孵育5分钟，凝胶也需要在预冷的转膜buffer中平衡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形转膜时间一般为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，昀好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜后，确定转膜效率至为重要，可通过以下方法检测：1、在转膜后使用丽春红（可逆染色）对杂交膜染色，同时使用考马斯亮蓝对转膜后的凝胶进行染色，检测凝胶上的蛋白是否已经完全充分的转移到杂交膜上。（膜有很清晰的蛋白条带，而凝胶上无蛋白存在）。2、使用预染蛋白Marker，检测Marker的转移情况，当和目的蛋白大小相当的Marker完全转移后即可停止，但是有时需要相对延长一些时间，因为Marker相对目的蛋白会比较容易转移。对于大分子量或者小分