第一章-酶工程

酶工程ENZYMEENGINEERING主编：陈守文酶工程EnzymeEngineering教材和教学参考书教材：《酶工程》（第二版）陈守文编著科学出版社2015课程简介教材和教学参考书教学参考书《酶工程》（第三版），郭勇，科学出版社，2009《现代酶学》（第二版），袁勤生，华东理工大学出版社，2001《酶学原理与酶工程》，周晓云，中国轻工业出版社，2007《酶工程》（第二版），罗贵民，化学工业出版社，2008课程简介课程主要内容酶工程（第一章）酶的生产酶的发酵（第二章）酶的分离工程（第三章）酶的改性固定化酶与固定化细胞（第四章）化学酶工程（第五章）生物酶工程（第六章）非水相酶催化（第七章）酶的应用酶反应器和酶传感器（第八章）酶及酶制剂的应用（第九章）课程简介教学目的和要求以酶学的内容为基础，酶的工程应用为主，融入各章节内容中通过本课程的学习，要求系统地掌握酶的生产、改性与应用的技术过程理解和掌握酶工程的主要理论、概念，掌握酶工程的研究方法，熟悉工程应用了解相关的新进展考核方式期末笔试（闭卷）70分，实验：20分，平时成绩：10分课程简介酶工程EnzymeEngineering第一章酶工程第一节：酶工程概述第二节：酶的催化特点以及影响因素第三节：酶的活力测定第四节：酶反应动力学第一章酶工程第一章酶工程酶及酶工程的研究意义酶--是具有特殊作用的蛋白质，能够在生命体内（包括动物、植物和微生物）催化化学反应，维持生命特征。第一章酶工程生物技术基因工程发酵工程细胞工程酶工程：酶的生产和应用的技术过程在食品、轻工、医药、化工、能源、环保、科研等领域得到广泛的应用。催化效率高专一性强反应条件温和第一章酶工程：基因拼接技术和DNA重组技术：改变生物的结构和功能：把微生物应用于工业生产过程酶工程——利用酶或细胞的催化作用，在特定的生物反应器，将原料转化成所需的产品并应用于社会生活的一门科学技术。第一章酶工程酶及酶工程的研究意义酶的研究简史最早4000年前的夏禹时代——酿酒技术公元前10世纪——豆酱的制作2700年前的周代——利用麦芽制麦芽糖2500年前——利用酒曲治疗消化疾病春秋战国时期——漆酶制作油漆中国古代第一章酶工程最早6000年前——古巴比伦人利用麦芽酿酒古埃及时代——酵母发酵面包磨粉、去糠、打碎麦芽萌发、浸润成酒发酵、装瓶酶的研究简史第一章酶工程古巴比伦人巴斯德微生物学的奠基人李比希有机化学创始人发酵与活细胞有关，发酵是整个细胞而不是细胞中的某些物质在起作用发酵是细胞中的某些物质起作用，这些物质只有在酵母细胞死亡裂解释放之后才能发挥作用第一章酶工程巴斯德和李比希的论战1833帕耶恩和珀索兹从大麦芽中分离出淀粉酶Monod用酒精处理麦芽水抽提液，得到白色无定形粉末，命名为diastase“变构模型”，定量解释某些酶活性可以通过与效应物结合进行调节，揭示了酶的调控作用1961莫诺提出“变构模型”Payen第一章酶工程酶的研究简史近代——酶作用学说的提出1894年，EmilFisher——锁钥学说酶分子和底物在结构上需有严格的互补关系底物须契合到酶活性中心，如钥匙插入锁中EmilFisher第一章酶工程酶的研究简史1913米彻利斯和曼吞建立米氏方程。从刀豆种子里分离出一种纯结晶体,然后把结晶体放进人尿中,这时人尿素便很快就分解成了二氧化碳和氨.萨姆纳发现,它的作用和脲酶一样.经进一步分析,证明这种结晶体就是脲酶.最后,萨姆纳证明脲酶确实是一种蛋白质第一章酶工程酶的研究简史1926萨姆纳得到尿酶结晶，证实酶的蛋白质本质近代——酶的本质和结构研究1926年，J.Sumner从刀豆中提取脲酶（urease），首次获得酶的结晶体1937年又获得过氧化氢酶结晶证实了酶是蛋白质获得1946年诺贝尔化学奖H2NNH2OH2OUrease2NH3CO2+第一章酶工程酶的研究简史现代酶学——快速发展时期核酸类酶（Ribozyme）的发现1982年，Cech发现四膜虫（Tetrahymena）的26SrRNA前体在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得成熟的rRNA第一章酶工程酶的研究简史EnzymeEngineering酶工程发展概况酶工程开始于人类有意识地去生产酶和酶制剂，并进行工业应用1894年，TakamineJoichi（高峰让吉）利用米霉菌固体培养法生产Taka淀粉酶（第一个商品酶制剂），并用作消化剂，开创了酶生产和应用的先例，其方法至今仍被采用1908年，胰酶皮革的软化1908年，细菌淀粉酶纺织品褪浆1911年，木瓜蛋白酶啤酒的澄清第一章酶工程EnzymeEngineering酶工程发展概况酶生产方法的突破加速了酶工程的发展从天然生物提取生物发酵生产——质的飞跃1949年，微生物液体深层发酵生产细菌-淀粉酶1960年，操纵子学说酶生物合成的调控揭示酶合成机制1980s，动植物细胞培养技术扩展了酶的来源第一章酶工程EnzymeEngineering酶工程发展概况酶的改性和固定化技术是酶工程发展的里程碑最早的固定化酶——1916年，发现吸附在骨碳上的蔗糖酶仍显示催化活力物理法1953年，用重氮化聚氨基苯乙烯树脂共价结合水解酶化学法1969年，固定化酶的工业应用——氨基酰化酶拆分DL-氨基酸生产L-氨基酸1971年，第一届国际酶工程学术会议在美国召开1973年，以E.coli为载体固定天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸1978年，固定化细胞生产-淀粉酶1980s中期，开发了固定化原生质体技术第一章酶工程EnzymeEngineering酶的催化特点及影响因素酶的催化特点1.极高的催化效率酶的催化速率是没有催化剂催化的化学反应速率的1012～1020倍，比一般催化剂催化反应的速率高107～1013倍。例如：H2O2的分解反应Fe3+催化，效率为6×10-4mol/(mol·s)过氧化氢酶催化，效率为6×106mol/(mol·s)过氧化氢酶将H2O2分解反应的活化能从75.24kJ·mol-1降低到8.36kJ·mol-1第一章酶工程Catalyst122222HOHO+O酶催化作用的特点酶催化作用效率高酶与非酶催化时所需的活化能示意图图中酶催化反应和非酶催化反应的活化能差异显著非酶催化反应酶催化反应活化能反应过程第一章酶工程酶的催化特点及影响因素酶的催化特点2.高度的专一性绝对专一性：只作用于一种底物；相对专一性：作用于一类化合物或一类化学键；立体异构专一性：旋光异构专一性、几何异构专一性第一章酶工程EnzymeEngineering酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现EnzymeEnzyme第一章酶工程EnzymeEngineering酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说锁－钥学说整个酶分子的天然构象是刚性的，酶表面具有特定的形状酶与底物的结合，如同一把“钥匙”对一把“锁”一样EnzymeEnzymeSubstratedonotmatchthebindingsiteSubstratecanmatchthebindingsite第一章酶工程EnzymeEngineering酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状EnzymeEnzyme++SubstrateProduct-1Product-2Transitionstateconformation第一章酶工程3.活性的可调节性4.活性的不稳定性酶促反应受一系列外界理化性质的影响，如：①底物浓度及酶与底物的相对浓度；②温度；③pH值；④激活剂；⑤抑制剂；⑥强酸/强碱；⑦重金属盐；⑧紫外线酶活性调控酶含量调控酶的催化特点及影响因素第一章酶工程酶的催化特点影响酶催化作用的因素1.底物浓度的影响υSVmaxKm1/2Vmax矩形双曲线：一级反应；混合反应；零级反应。底物抑制：有些酶在高底物浓度下，速度没有维持较高水平，反而下降的现象第一章酶工程酶的催化特点及影响因素3.酶浓度的影响υ=κ·[E]底物浓度够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。2.产物浓度的影响反馈调节作用：许多代谢途径的中间产物或终产物是酶的变构剂，使酶变构从而影响其反应速度。影响酶催化作用的因素第一章酶工程酶的催化特点及影响因素4.温度的影响温度，t（℃）酶催化反应速度,V0（M/min）在一定温度范围内，反应速度随温度升高而加快。超过一定范围，温度的升高导致酶三维结构的变化，甚至变性，催化活性下降5.pH的影响T(pH)υ影响酶催化作用的因素第一章酶工程酶的催化特点及影响因素当酶分子处于最适pH值反应介质中时，使酶促反应速度达到最大值。6.抑制剂(inhibitor)的影响凡能降低酶催化反应速率的物质都称之为抑制剂抑制剂与酶的必需基团（包括活性基团及辅基）结合，改变其结构与性质，引起酶反应速率下降抑制剂对酶有选择性，不包括酶蛋白的水解及变性失活作用影响酶催化作用的因素第一章酶工程酶的催化特点及影响因素7.激活剂(activator)的影响（1）无机离子激活剂：Cl-,Br-,I-,Zn2+,Mg2+,Ca2+,Na+（2）小分子有机化合物：抗坏血酸，半胱氨酸，谷胱甘肽（3）生物大分子激活剂：激酶影响酶催化作用的因素第一章酶工程酶的催化特点及影响因素酶的活力测定酶活力又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可用酶催化的某一化学反应的速率来表示。化学反应的速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低第一章酶工程酶活力单位酶活力单位是表示酶量多少的单位。酶活力单位（U）特定条件下（最适温度、pH），每1min催化1μmol底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位酶的活力测定第一章酶工程国际酶活力单位—催量（kat）1kat=1mol/s=60mol/min=6×107U在最适条件下，每秒钟催化1mol的底物转化为产物的酶量。（1972年国际酶学委员会）酶活力单位酶的活力测定第一章酶工程酶的比活力酶的比活力可用来表示酶制剂的纯度或活力的高低，是酶纯度的一个指标。在特定条件下，单位质量的酶（蛋白或RNA)所具有的酶活力单位数称为酶的比活力（specificactivity）。酶的比活力=酶活力（U）/mg（蛋白或RNA)酶的活力测定第一章酶工程酶的转换数和催化周期转换数（Kcat）酶催化效率的指标，指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数一般用每μmol的酶活力单位数IU来表示（min-1）酶分子只有一个催化中心催化中心活性等于摩尔催化活力例如：单体酶酶分子有n个催化中心催化中心活性等于摩尔催化活力除以n例如：寡聚酶酶的活力测定第一章酶工程催化周期（T）T=1/Kcat酶的催化周期为转换数的倒数，单位为毫秒(ms)或微秒(μs)。指酶进行一次催化所需的时间。酶的转换数和催化周期酶的活力测定第一章酶工程酶活性的测定要求测得的反应速度必须和酶的浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。酶活力测定是通过“可视化”酶催化其特定底物为产物，可用终止反应法或连续反应法进行测定。活力的测定方法酶的活力测定第一章酶工程酶反应进程曲线：纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线：纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线，检验反应测定系统是否合适。通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线酶的活力测定活力的测定方法第一章酶工程酶活力与底物浓度、酶浓度、pH值、温度、激活剂和抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都