量值溯源和不确定度及方法学评价

量值溯源临床实验室通过校准为其检测系统确定标准值。为保证检测结果的准确性和一致性，必须保证参考物设定值可溯源到可能的参考方法和/或可能的高一级参考物质，以使常规的检测系统对患者样本的检测，在计量单位一致的前提下，得到和参考系列相同的检测量值。一、量值溯源的概念通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测定结果或标准值能够与规定的参考标准（通常是国家标准或国际标准）联系起来的特性，称为量值的溯源性（traceability）。溯源顺序通常采用溯源等级图来描述。要求校正常规方法的参考物必须溯源到国家或国际规定的参考方法上，最好是溯源到SI（国际单位制），SI单位表示了该物质量值的准确性达到计量基准，它具有非常小的不确定度。除了保证参考物的溯源性外，临床实验室和生产厂商必须对检测系统各组分（仪器、试剂、参考物、和操作程序）实行严格的标准化程序，才能实现患者检验结果的溯源性。二、量值溯源的意义临床医生通常将实验室检验结果与参考区间和医学决定水平进行比较，结合患者其它医学信息做出临床判断。但如果实验室间的检验结果一致性不好，使参考区间和医学决定水平有差异，将混淆临床医生的医学判断，并可能导致错误的医学决策。特别对于由科学家或专业协会建议和提倡运用共同判断标准对治疗进行干预，例如在高胆固醇血症和糖尿病的治疗指南中，提出根据检验结果的临床诊断值、干预值和目标值等。实验室间的检验结果一致性不好，可能导致对检验结果的错误解释和对疾病的错误干预。因此，有必要开展量值溯源和检测系统的标准化，以实现各实验室测定结果的一致性或不同医院的实验室检验结果的互认性，也即改进试验结果在空间和时间上的可比性。三、参考物的量值溯源在临床实验室的定量分析中，通过不同级别的测量程序、参考物和校正物，实现连续测量。用一个测量程序为某种物质定值，该物质用作下一级测量程序的校正物。依此类推，形成了一条不间断的比较链，也称溯源链。（一）参考物量值溯源的意义使用公认的参考方法来标化测定参考物，通过严密的测定程序，所得到的参考物的测定值是可靠的，该参考物的量值可溯源到上级参考方法和/或参考物质。在常规临床实验室，用该参考物去校准常规的检测系统。经过一系列的检测过程，得到患者样本的分析物含量。该样本的分析物含量接近使用参考方法测定所获得的结果。因此，通过溯源的参考物校准常规方法，测定患者样本所得结果的准确性可源溯到参考方法。常因为参考物是处理过的样本，它和新鲜患者样本的基质有差异，使参考方法的准确度不能完全通过参考物传递给患者样本，所以对参考物的量值可能有一定的调整。常规测定方法中量值溯源参考物使用的目的是，被测定物的测定结果要求接近通过参考方法所获得的结果。因此，通过溯源的参考物来校准常规测定方法得到的结果的真实性就可追溯到参考方法。（二）参考物的量值溯源程序1．溯源链和校准层次根据溯源的定义，一条连续的、可溯源的、分层次的比较链，每条链有已知的测定不确定度，使参考物的值或患者样本测定结果可溯源到国家或国际规定的参考方法，如图3-3所示。材料校准方法定值SI-单位一级参考测定方法二级参考测定方法厂家选择的测定方法厂家的工作测定方法终端用户的常规测定方法一级参考物二级参考物厂家工作校准品厂家生产的校准品常规样本测定结果溯源不确定度图3-3参考物的量值溯源等级图图3-3描述了多层次多水平相互交错的测定方法和校准物质，箭头方向表示相互的关系。在每一级水平，图左边的参考物用作校准右边的测定方法，后者可为下一级参考物定值。SI单位溯源链开始于被测物顶端（检测系统、分析物、测定值的种类），遵循SI单位的溯源路径（通过一级参考测定方法和一级参考物），溯源链结束于测定患者样本的终端用户常规测定方法。溯源链自上而下各环节的溯源性逐渐降低，而不确定度则逐渐增加。国际计量局、国家计量局、被认可的参考实验室可为二级参考物定值；厂家为终端用户提供常规测定方法的溯源文件。2．参考物传递方案（1）SI单位溯源链：理想的溯源链终点是SI，传递如图3-3。但一些分析物无公认的参考物质或参考方法，就不能提供其溯源路径。例如，镁在血浆中以与蛋白结合、离子形式和复合物形式存在，镁的测定表达为总的离子浓度形式和复合物形式。由于有不同的量值，其参考物需要追踪各自的溯源路径，某些溯源路径不能提供或从技术方面还得不到某些分析物的超纯物质（一级参考物），使得不能实现溯源。因此，在生物样本中，根据其病理生理特点，用SI单位表示的分析物实际上是一个种类或一组物质而不是单一物质。如某分析物在血清中，可能以完整的形式、降解产物或复合物形式存在；也可能因不同的异构体或糖基化的不同而具有不均匀性。另外，对于SI单位标识的分析物，用不同的测定方法测定（主要是免疫方法），因使用的抗体所作用抗原表位的不同，可能显示不同的分析特性。如人绒毛膜促性腺激素（HCG）以不同的分子形式存在于血清中，一些形式表达在妇女的妊娠期间，另一些形式表达在某些肿瘤疾病中。因此，测定不同的表达形式，用于不同的诊断目的。（2）其它参考物溯源方案：对没有SI单位的分析物，可溯源到“国际惯例”表示的参考物质和参考测定方法。国际惯例的参考物质和参考测定方法不等同于SI单位溯源链中的一级参考物和一级参考方法，是国际惯例使用的替代品和替代方法。对于不能溯源到SI单位的物质的溯源问题分四种情况，如图3-4、3-5、3-6、3-7所示。图3-4-a表示有参考测量程序和参考物的分析项目的溯源，如皮质醇激素（图3-4-b）、HbA1c、某些酶活性。由IFCC工作组/分委员会提供参考测量程序（RMP）和参考物（RM）；图3-5表示有参考测量程序而没有参考物的分析项目的溯源，该类项目以凝血因子的测定为多。凝血因子具有一定的生物学活性，常采用以“正常血浆”作为参考物的凝固试验（生物学效应）。该试验被WHO承认，这类项目大约有30项；图3-6表示有参考物而无参考测量程序的分析项目的溯源，这类项目大约有300项,如血浆蛋白类；图3-7表示既无参考测量程序（RMP）又无参考物（RM）的分析项目的溯源,如肿瘤标志物、某些酶类，可溯源到厂家设定的参考方法。表3-2列举了一些临床常规检测项目的上级参考方法或参考物。常规实验室了解各溯源方式，为获得其分析测定项目的溯源依据提供路径。图3-4-a具有参考测量程序和参考物的量值溯源等级图材料校准方法定值国际惯用参考测定方法国际惯用参考物厂家的工作校准品厂家生产的校准品常规样本测定结果厂家选择的测定方法厂家的工作测定方法终端用户的常规测定方法端图3-4-b皮质醇激素测定溯源到SI单位的量值溯源等级图材料校准方法定值参考物（nmol/l）NISTSRM921皮质醇IFCC-IRMM-451（系列人血清）厂家生产的校准品常规样本重量测定ID-GC/MS厂家自己的测定方法终端用户测定方法(免疫测定)结果（nmol/l）材料校准方法定值国际惯用参考测定方法厂家的工作校准品厂家生产的校准品常规样本厂家的工作测定方法终端用户的常规测定方法测定结果图3-5具有参考测量程序而没有参考物的量值溯源等级图-图3-6具有参考物而无参考测量程序的量值溯源等级图图3-7无参考测量程序和参考物的量值溯源等级图材料校准方法定值定值的国际方案国际惯用参考物厂家的工作校准品厂家生产的校准品常规样本厂家选择的测定方法厂家的工作测定方法终端用户常规测定方法测定结果材料校准方法定值厂家的工作校准品厂家生产的校准品常规样本常规厂家选择的测定方法厂家的工作测定方法终端用户的常规测定方法测定结果表3-2常规检测项目的溯源性示例常规项目（常规方法）参考方法或参考物酸性磷酸酶（萘酚磷酸）厂家指定的参考方法前列腺酸性磷酸酶（萘酚磷酸）厂家指定的参考方法白蛋白（plus）CRM470白蛋白（BCG）CRM470-1-抗胰蛋白酶（免疫透射比浊）CRM470碱性磷酸酶（IFCC）IFCC催化活性浓度测定的参考方法ALT/ALAT（IFCC有/无PYP）IFCC催化活性浓度测定的参考方法总淀粉酶（IFCC）IFCC催化活性浓度测定的参考方法载脂蛋白A-1（免疫透射比浊）WHO国际参考品SP1-01载脂蛋白B（免疫透射比浊）WHO国际参考品SP3-07AST/ASAT（IFCC有/无PYP）IFCC催化活性浓度测定的参考方法碳酸氢盐新标准（纯物质称量）总胆红素（DPD）acc.toDoumas总胆红素（J-G法，M-E法）acc.toDoumas直接胆红素（J-G法，M-E法）厂家指定的参考方法C3-c补体（免疫透射比浊）CRM470C4补体（免疫透射比浊）CRM470钙（邻甲酚酞络合酮，O-CPC）原子吸收氯（ISE）电量滴定胆固醇（CHOP-PAP）a)ID-MS法b)Abell-Kendall法胆碱酯酶（丁基硫代胆碱）厂家指定的参考方法铜蓝蛋白（免疫透射比浊）CRM470肌酸激酶/CK（IFCC，DGKC）IFCC催化活性浓度测定的参考方法肌酸激酶MB/CK-MB（IFCC改良）IFCC催化活性浓度测定的参考方法肌酐（酶比色法plus）ID-MS肌酐（Jaffe）ID-MSCRPC反应蛋白（免疫透射比浊）CRM470CRPC反应蛋白（颗粒增强，免疫透射比浊）CRM470果糖胺（NBT）厂家指定的参考方法GGT（IFCC）IFCC催化活性浓度测定的参考方法GLDH（DGKC1972）厂家指定的参考方法葡萄糖（GOD-PAP,HK）ID-MSHBDH（DGKC1972）厂家指定的参考方法HDL-胆固醇CDC〔用葡聚糖硫酸盐沉淀和AbellKendall〕结合珠蛋白（免疫透射比浊）CRM470Kappa（免疫透射比浊）CRM470（通过IgG、IgA、IgM）免疫球蛋白G（免疫透射比浊）CRM470免疫球蛋白A（免疫透射比浊）CRM470免疫球蛋白M（免疫透射比浊）CRM470铁（ferrozine）一级参考物（纯物质称量）乳酸（酶比色法）一级参考物（纯物质称量）Lambda（免疫透射比浊）CRM470（通过IgG、IgA、IgM）LDHL-P（IFCC）IFCC催化活性浓度测定的参考方法LDL-胆固醇CDC〔用肝素/镁（超离心）和Abell-Kendall〕脂肪酶（比色法）厂家指定的参考方法镁（xylidylblue）原子吸收前白蛋白（免疫透射比浊）CRM470无机磷（磷钼酸UV）一级参考物（NERL）（纯物质称量）钾（ISE）火焰光度法总蛋白（双缩脲）SRM927c水杨酸（比色法）一级参考物（纯物质称量）钠（ISE）火焰光度法转铁蛋白（免疫透射比浊）CRM470甘油三酯（GPO-PAP）ID-MS,以一级参考物校准甘油三酯（去除甘油空白）SRM909b尿素/BUN（脲酶UV）SRM909b尿酸（酶比色法plus）ID-MS注：1．CRM(certifiedreferencematerial)＝欧洲共同体认可的参考物，2．SRM(standardreferencematerial)＝美国标准参考物3．ID-MS(isotope-dilutionmassspectrometry)＝同位素稀释－质谱分析4．CDC(Centersfordiseasecontrol)=美国疾病控制中心3．测量不确定度的表达测量不确定度是量值溯源过程中不可避免的，被测物的不确定度贯穿整个量值溯源链，开始于一级参考物提供者，延伸到体外诊断试剂生产厂家，以及为参考物定值的过程。4．校准溯源的验证校准溯源验证的目的是确定终端用户获得的结果与贯穿于量值溯源链的参考测定方法和/或参考物质的一致性。验证过程有三个要素：①由体外诊断试剂生产厂家测定的值应与用参考方法测定的数值相同；②由体外诊断试剂生产厂家用参考方法测定结果在数学上相等的评估，即线性回归方程斜率=1、截距为零；③要求厂家参考物测定结果有互通性。5．量值溯源的长期评估为确保在任何时候量值可溯源，要求有一套系统程序来评估参考物的后期性能和进行必要的纠正，室间质量评价（externalqualityassessment,EQA）是最易实现的量值溯源的长期评估方法。四、测量不确定度1．