ACQUITY-UPLCTM-BEH色谱柱的维护和使用指南

ACQUITYUPLCTMBEH色谱柱的维护和使用指南感谢您选择Waters公司的ACQUITYUPLCTMBEH色谱柱，它是专门为了配合Waters的ACQUITYUPLC色谱系统设计的。它采用超纯试剂在满足GMP要求并获得ISO9001认证的条件下生产。ACQUITYUPLCTMBEH的每批填料都会用酸性、碱性和中性化合物的色谱分离进行检验，并且填料的指标控制非常严苛，以保证色谱柱卓越的重现性。每一根ACQUITYUPLCTMBEH色谱柱都是单独检测，色谱柱的性能图谱和填料的批次检验证书一起存储在eCordTM芯片上。请注意：我们不建议将ACQUITYUPLCTMBEH色谱柱用于普通的HPLC仪器。内容提要：第一节开始A/色谱柱的连接B/色谱柱安装C/色谱柱平衡D/eCordTM安装E/新色谱柱柱效测试第二节色谱柱的使用A/样品的准备B/pH范围C/溶剂D/压力E/温度第三节色谱柱的清洗、再生和保存A/清洗和再生B/保存第四节eCordTM智能芯片技术介绍A/简介B/安装C/生产信息D/色谱柱使用信息其它补充信息A/延长ACQUITYUPLCTMBEH色谱柱使用寿命的小秘诀B/ACQUITYUPLCBEH色谱柱的建议流速和压力C/开始使用ACQUITYUPLCTMBEHHILIC色谱柱第一节开始每一根ACQUITYUPLCTMBEH色谱柱的eCordTM智能芯片上都有针对填料的分析报告和针对色谱柱的性能报告：分析报告是针对填料的批次测试报告，其中包括填料的批号、非键合颗粒以及键合颗粒的分析、测试图谱和测试的色谱条件；性能测试报告是针对每根色谱柱的测试报告，包括以下信息：填料批号、色谱柱序列号、塔板数、拖尾因子、容量因子以及测试的色谱条件。用户应该储存这些信息用于将来的参考。A.色谱柱的连接ACQUITYUPLCTM系统是使用经过专门设计的可耐受高压并且有昀小柱外体积的管路和接头，昀优化的色谱柱进口管路（订货号430001084）是随仪器配置的，进样阀末端的管路清晰地用蓝色标记标示出来，将这根管路的另一端插入UPLC色谱柱的入口端并用5/16英寸的扳手拧紧。关于ACQUITYUPLCTM色谱柱的出口管路，请参考ACQUITYUPLCTM系统操作手册的相关检测器部分（货号71500082502）。B.色谱柱安装说明：以下流程中给出的流速适用于50×2.1mmI.D.,1.7um粒径的色谱柱，对于其它规格的色谱柱需要根据其它补充信息中的表格B中建议的流速和压力进行调整1.Purge含有任何缓冲盐的泵系统，将色谱柱入口端连接到进样器的出口端（先不要接检测器）2.在0.1ml/min流速条件下用100％纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱，然后在5分钟内将流速升至0.5ml/min。3.当溶液均匀地从柱子出口流出时，停掉流速，将色谱柱出口端接到检测器上（这样操作可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）4.按照步骤2的方法逐渐提高流速5.一旦压力达到稳定值并且基线平衡好后，则进入下一步操作6.说明：如果流动相中含有低浓度的流动相改性剂如离子对试剂，要达到完全平衡可能需要100倍甚至200倍柱体积的流动相消耗；并且，对于含有甲酸或甲酸铵的流动相也需要较长的时间达到初始平衡C.色谱柱平衡ACQUITYUPLCTM色谱柱是用100％乙腈保存的，在使用其它的流动相系统前一定要确保流动相和色谱柱内溶剂的“相容性”：至少用10倍柱体积的流动相平衡色谱柱的（见表一中不同规格色谱柱的柱体积数值），当柱压平稳后即可认为色谱柱基本上达到了热力学平衡。表一：不同规格ACQUITYUPLCTM色谱柱的柱体积（乘以10作为冲洗色谱柱所用的流动相体积）柱长(mm)内径1.0mm内径2.1mm200.016ml0.07ml300.024ml0.1ml500.04ml0.2ml1000.08ml0.4ml1500.12ml0.5ml为了避免流动相中的缓冲盐在色谱柱或系统中析出，在换上流动相之前，需要用5倍柱体积的含水的有机溶剂的混合溶液（要求有机溶剂的含量比流动相中的含量略低或相等，将缓冲盐溶液用水替代：如在使用60/40的甲醇/缓冲盐流动相之前先用5倍柱体积的60/40甲醇/水溶液冲洗色谱柱）。对于ACQUITYUPLCTMHILIC色谱柱来讲，用50倍柱体积的50/50乙腈/水平衡，如果流动相中含有缓冲盐则要求流动相中缓冲盐的昀终浓度是10mmol/L（以水相部分的浓度计算）；在开始进样前，用20倍柱体积起始流动相进行平衡。D.eCord安装将eCord放至色谱柱柱温箱旁边，由于eCordButton是磁化的，因此不需要专门进行定位。E.初始色谱柱柱效测试•在开始使用色谱柱分析样品前先进行柱效测试，测试的样品可以是您实验室中常用的测试物或几种测试物的复合物；或者使用Waters柱性能测试报告中测试柱效所用的测试物二氢苊（说明：使用Waters的测试条件和样品进行测试，如果在等度条件下测试结果比标示值略低是正常的）•计算塔板数，用这个数据作为对照，周期性地监控色谱柱的柱效•随着色谱柱的使用，需要定期作同样的测试以便追踪色谱柱的性能变化，在不同一些UPLC仪器上测试的结果可能有一些差别，这同诸如管路连接、操作环境、系统电路、溶剂以及试剂的质量、色谱柱条件和操作者的技术都可能有关系第二节色谱柱的使用为确保ACQUITYUPLCBEH色谱柱具有稳定的性能，请遵守以下操作指导：A/样品的制备•样品中的杂质通常会污染色谱柱，建议采用合适的SPE技术（Oasis或Sep-pak）净化样品来避免这个问题，详情请参考•用流动相或比流动相洗脱强度弱的溶液（含有较少有机溶剂）溶解或稀释样品可以获得昀好的峰形和检测灵敏度•如果样品在流动相中不溶解或者溶解度很差时，要确保样品、样品溶液和流动相是互溶的，以避免样品在流动相中析出•用0.2μm的滤膜过滤样品以充分去除颗粒杂质，如果样品溶解在含有机溶剂的改性剂（如乙腈、甲醇）的溶剂中，在选择时要注意膜的材质不会在该溶剂中溶解，也可以在8000rpm转速的条件下离心20分钟后移取上清液进样•对于HILIC色谱柱的应用，样品必须溶解在100％纯有机溶剂中（如乙腈）B/pH范围ACQUITYUPLCBEHC18,C8,Phenyl色谱柱的建议pH使用范围是1－12，ShieldRP18的pH使用范围是2-11，HILIC是2-8（表二列出了常用的缓冲盐和改性剂）。并且，色谱柱的寿命和操作温度、缓冲盐的浓度也密切相关。比如在高温条件下使用pH8的磷酸盐缓冲液流动相则会使色谱柱寿命缩短。说明：在极端pH、高温或极高压力条件下使用会缩短色谱柱寿命。表二、ACQUITYUPLCBEH色谱柱建议使用的缓冲盐体系缓冲盐/流动相改性剂PKa缓冲范围±1pH单位挥发性?是否MS兼容？备注TFA0.3-是是离子对试剂，能够抑制MS信号,通常使用的浓度范围为0.02-0.1%乙酸4.76-是是同乙酸铵一起使用具有昀大的缓冲能力,通常使用的浓度范围0.1-1.0%甲酸3.75-是是同甲酸铵一起使用具有昀大的缓冲能力,通常使用的浓度范围0.1-1.0%乙酸铵4.763.76-5.76是是通常使用1-10mM浓度,注意钾盐和钠盐是非挥发性的甲酸铵3.752.75-4.75是是通常使用1-10mM浓度,注意钾盐和钠盐是非挥发性的磷酸盐12.151.15-3.15否否传统的低pH值缓冲体系,UV透光度很好磷酸盐27.26.2-8.2否否当pH值超过7时,降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以将色谱柱寿命昀长化N-甲基吗啡啉~8.47.4-9.4是是通常使用浓度是不超过10mM氨水9.2是是保持浓度不超过10mM,温度在30摄氏度以下碳酸氢铵10.3(HCO32-)9.2(NH4+)6.3(H2CO3-)6.8-11.3是是通常使用浓度为5-10mM(使用MS需保证离子源温度超过150摄氏度);用氨水或乙酸调节pH值;在pH10的情况下具有很好的缓冲能力说明:使用碳酸氢铵而非碳酸铵乙酸铵9.28.2-10.2是是通常使用浓度为1-10mM甲酸铵9.28.2-10.2是是通常使用浓度为1-10mMCAPSO(3-环已胺基-2-羟基丙磺酸)9.78.7-10.7否否两性离子缓冲液,同乙腈互溶,通常使用浓度为1-10mM,气味很小Glycine甘氨酸2.4,9.88.8-10.8否否两性离子缓冲液,比使用硼酸盐对柱子的损伤更小些1-甲基哌啶10.29.3-11.3是是通常使用浓度是1-10mMCAPS10.49.5-11.5否否两性离子缓冲液,同乙腈互溶,通常使用浓度为1-10mM,气味很小三乙胺(乙酸盐)10.79.7-11.7是是通常使用浓度为0.1-1.0%.当使用乙酸滴定时形成挥发性的缓冲盐(不可用盐酸或磷酸);在pH7-9时分析DNA被用作离子对试剂吡咯烷11.310.3-12.3时是温和的高pH缓冲液体系,对色谱柱损伤很小C/溶剂为了使色谱柱的性能达到昀好，建议使用高品质的色谱溶剂。所有水相流动相在使用前都必须经过0.2um滤膜过滤，建议使用GelmanAcrodisc过滤器。含有悬浮颗粒的溶剂通常会堵塞色谱柱入口滤片，这将导致柱压升高，分离度变差。D/压力尽管ACQUITYUPLCBEH色谱柱能够耐受15000psi的压力，但为了获得更长的使用寿命，我们还是建议色谱柱在10000psi（689bar或69Mpa）压力下使用。这是在速度（流动相线速度或体积流速）、分辨率和色谱柱使用寿命之间的一个平衡。而且，造成压力急剧升高的梯度运行也会缩短色谱柱的使用寿命。说明：在极端pH、高温或极高压力条件下使用会缩短色谱柱寿命。E/温度ACQUITYUPLCBEH色谱柱的建议使用温度是20－90度，这是为了提高分离选择性、降低流动相粘度并同时提高传质速率。当在高pH条件下使用时，建议使用较低的温度，在高温条件下如超过70度时也会使色谱柱的使用寿命缩短说明：在极端pH、高温或极高压力条件下使用会缩短色谱柱寿命。第三节色谱柱清洗、再生和保存A/清洗和再生色谱柱峰形发生改变、色谱峰分叉、出现肩峰、保留时间波动、分辨率降低或者压力升高都表明色谱柱被污染了，用有机溶剂冲洗（请注意避免盐的析出）通常可以洗去这些污染物，如果有机溶剂清洗不能解决问题，请采用以下清洗和再生的过程。根据样品的性质以及你了解的污染物的性质选择清洗方法，用50/50乙腈/水清洗ACQUITYUPLCBEHHILIC色谱柱以去除极性污染物，如果不能解决问题，用5/95的乙腈/水冲洗。用20倍柱体积的HPLC溶剂清洗色谱柱，将流动相温度升至35－55度可以提高清洗的效率。如果您的柱子在清洗后柱效还是没有改变，请与Waters公司联系。表三、色谱柱清洗过程极性样品非极性样品蛋白质样品1、水1、异丙醇或者异丙醇和水的混合溶液（注意避免盐析出）选择1、反复进几针DMSO2、甲醇2、四氢呋喃3、四氢呋喃3、二氯甲烷4、甲醇4、正己烷选择2、10-90%的B流动相冲洗（A为0.1%的TFA水溶液；B为0.1%的TFA的乙腈溶液）5、水5、异丙醇或者异丙醇和水的混合溶液（注意避免盐析出）6、流动相6、流动相选择3、用7M的盐酸胍或7M尿素水溶液清洗B/色谱柱的保存在室温条件下，如果四天之内不使用ACQUITYUPLC色谱柱，请将柱子保存在100％乙腈中；对于高温条件下的应用，在工作结束后即快速将色谱柱保存在100％乙腈中以延长色谱柱的使用寿命。不要将色谱柱保存在缓冲盐流动相条件下，如果流动相中含有缓冲盐，先用10倍柱体积的液相色谱级水冲洗色谱柱然后换上100％乙腈保存，将柱子两端的堵头拧紧以防止柱床干涸。如果在室温条件下，超过四天不使用ACQUITYUPLCBEHHILIC色谱柱，请将色谱柱保存在95/5乙腈/水中，如果所使用的流动相中含有缓冲盐，请先用10倍柱体积的含水乙腈/水溶液冲洗。说明：如果色谱柱已经使用了含有甲酸或甲酸铵等的流动相后用100％乙腈冲洗或保存，则该柱