CRISPR-Cas9系统作用机制及研究进展

收稿日期：２０１６－０３－１１；修回日期：２０１６－１２－１６基金项目：淡水鱼育种国家地方联合工程实验室开放项目（ＫＦ－２０１５－００３）；东北林业大学生命科学学院大学生创新项目作者简介：艾元立（１９９３－　），男，本科生，研究方向为发育生物学，[e-mail]．通信作者：梁　洋（１９７４－　），女，高级工程师，博士，研究方向为发育生物学，[e-mail]／Ｃａｓ９系统作用机制及研究进展艾元立１，２，陈康轩２，胡菲阳２，闫学春１，梁　洋１，２（１．中国水产科学研究院黑龙江水产研究所淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室／淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，哈尔滨１５００７０；２．东北林业大学生命科学学院，哈尔滨１５００４０）中图分类号：Ｓ８１３．３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－７０３４（２０１７）０４－００７４－０５关键词：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统；基因座；人工核酸酶；基因编辑；作用机制摘　要：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｃａｓ９）是进行基因编辑的新方法，通过设计特异性靶点ＲＮＡ，将Ｃａｓ９核酸内切酶带到基因组上的具体靶点，通过对特定基因位点切割，从而达到基因编辑目的。该技术自发明以来，迅速应用于人类多种细胞系、小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、羊、水稻、小麦、拟南芥、果蝇、细菌等动植物和微生物的研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。文章对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的基因座结构、作用机制和研究进展进行综述，旨在为生命科学领域研究人员提供参考。ＡｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍＡＩＹｕａｎｌｉ１，２，ＣＨＥＮＫａｎｇｘｕａｎ２，ＨＵＦｅｉｙａｎｇ２，ＹＡＮＸｕｅｃｈｕｎ１，ＬＩＡＮＧＹａｎｇ１，２（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＡｑｕａｔｉｃＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＢｒｅｅｄｉｎｇ／ＮａｔｉｏｎａｌＬｏｃａｌＪｏｉｎｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＦｉｓｈＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＲｉｖｅｒＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ）Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ；ｇｅｎｅｌｏｃｕｓ；ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｎｕｃｌｅａｓｅ；ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ；ａｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ９（Ｃａｓ９）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ．ＴｈｅＣａｓ９ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓｏｆｇｅｎｏｍｅｂｙｄｅｓｉｇｎｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｔａｒｇｅｔＲＮＡ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｓａｃｈｉｅｖｅｄｂｙｃｕｔｔｉｎｇｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｌｏｃｉ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｂｅｅｎｒａｐｉｄｌｙａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎａｎｉｍａｌｓ，ｐｌａｎｔｓａｎｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｓｉｎｃｅｉｔｓｉｎｖｅｎｔｉｏｎ，ｓｕｃｈａｓｈｕｍａｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓ，ｍｉｃｅ，ｒａｔｓ，ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，ｐｉｇｓ，ｓｈｅｅｐ，ｒｉｃｅ，ｗｈｅａｔ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｅｔｃ．Ｉｔｈａｓｂｅｃｏｍｅａｈｏｔｓｐｏｔｉｎｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈａｔｐｒｅｓｅｎｔ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｓｕｍｍａｒｉｚｅｓｔｈｅｌｏｃｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ，ａｎｄａｉｍｓａｔｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．　　基因组编辑技术（ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ）是一种可以在基因组水平上对ＤＮＡ序列进行改造的遗传操作技术，目前已成为研究基因功能最重要手段之一。在过去的十年间，随着人工核酸酶（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，ＥＥＮ）介导的基因组编辑技术的日渐成熟［１］，极大地改善了早期基于同源重组的基因打靶技术效率低的问题，使得研究人员可以操作各种细胞类型和生物的任何基因。从技术的发展来看，ＥＥＮ主要包括三种主要类型：锌指核酸酶（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦｎ）、转录激活因子样效应物核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮ）及ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术［２］。ＺＦＥ是第一代人工核酸内切酶，利用它可以在较为复杂的基因组特定位置上制作ＤＮＡ切口，虽然这样能改善早期基因打靶效率低的问题，但ＺＮＦ的制备复杂，成本比较昂贵，而且ＺＦＥｓ在细胞内会产生细胞毒性［３］；第二代人工核酸酶类ＴＡＬＥＮ的出现在很大程度上替代了ＺＮＦ，２０１０年ＴＡＬＥＮ蛋白在酵母中的成功应用被首次报道，并在２０１２年被《Ｓｃｉｅｎｃｅ》杂志评为十大科学突破之一，其制备较为方便，且成本相对低廉［４］。但是ＴＡＬＥＮ存在的一个·４７·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０１７（０４上）：７４－７７，８３比较大的问题是脱靶危险较高，影响基因操作效率。２０１３年年初，一种全新的ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ９）基因组定点改造技术出现了［５］，与之前的技术相比，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的靶位点选择范围要比ＺＦＮ甚至ＴＡＬＥＮ大得多，基本可以在任意ＤＮＡ位点进行有效断裂，且避免了ＺＦＮ和ＴＡＬＥＮ的难以组装、脱靶等问题，能实现更精确的基因编辑修饰［６］。该技术自发明以来，迅速被研究人员接受，并成功应用于大肠杆菌、肺炎双球菌、酿酒酵母、斑马鱼、小鼠、人类多种细胞系、果蝇、线虫、大鼠、猪、山羊细胞、水稻、小麦、拟南芥等动植物及微生物的研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。本文对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的基因结构、作用机制和研究进展进行了介绍。１　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统基因座结构　　ＣＲＩＳＰＲ是原核生物抵抗外来基因片段，如噬菌体、质粒等的免疫防御系统，是成簇的、规律间隔的短回文重复序列［７］。２０世纪８０年代，随着细菌全基因组测定的完成，人们发现ＣＲＩＳＰＲ序列广泛存在于古细菌及细菌基因组中，且约９０％的古细菌及４０％的细菌存在类似位点［８］。　　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统（见图１）结构比较固定，由５′端的ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ蛋白编码基因和ＣＲＩＳＰＲ基因座组成。ＣＲＩＳＰＲ基因座主要由前导区、同向重复序列与间隔序列构成的多段Ｒ－Ｓ结构组成［９］。前导区一般位于ＣＲＩＳＰＲ位点上游，是由３００～５００ｂｐ碱基组成的一个富含ＡＴ的区域，一般被认为可能是ＣＲＩＳＰＲ簇的启动子序列，这个区域在种内是比较保守的，但在种间却有显著差异。重复序列由２１～５０ｂｐ的碱基组成，由于含有回文序列，可形成发卡结构，这段序列相对保守，一般只存在１～３个碱基差异，这种差异被称为退化重复（ＤＲ）［１０］。间区由１７～８４ｂｐ碱基组成，平均长度在３６ｂｐ左右，可特异识别外源ＤＮＡ，研究发现，在同一个ＣＲＩＳＰＲ位点中，基本上没有相同或比较相似的间区。５′端的ｔｒａｃｒＲＮＡ是ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统第二个组成的部分，属于非蛋白编码ＲＮＡ，主要用来完成ｃｒＲＮＡ成熟和成熟之后的ＤＮＡ剪切［１１］。　　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统另一重要结构是Ｃａｓ蛋白编码基因，属于一个较大的多态性家族蛋白。编码的蛋白质含有与核酸发生作用的功能域，兼具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性。Ｃａｓ蛋白基因一般位于ＣＲＩＳＰＲ位点下游，或者分散在基因组的其他地方。到目前为止，已有４０多种伴随ＣＲＩＳＰＲ位点的Ｃａｓ蛋白被鉴定［１２］，是ＣＲＩＳＰＲ位点的核心蛋白，与ＣＲＩＳＰＲ区域共同发挥作用。根据Ｃａｓ基因核心元件序列的不同，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统被分为３种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型、Ⅲ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统需要多种蛋白形成复合物才能行使功能，而Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统仅需要一种蛋白，即Ｃａｓ９核酸酶参与就能发挥功能。Ｃａｓ９核酸内切酶包括位于Ｎ端的ＲｕｖＣ结构域和中部ＨＮＨ核酸酶活性的结构域，能够针对具有特异性ＤＮＡ序列的ＤＮＡ进行双链剪切［１３］，是Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统必不可少的组分，因此Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统最适合在基因组编辑中应用。２　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统作用机制　　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的三个必要组成部分，即ＣＲＩＳＰＲ基因座、ｔｒａｃｒＲＮＡ及Ｃａｓ９核酸内切酶分别发挥不同的作用机制。首先是ＣＲＩＳＰＲ高度可变间隔区的获得，即ＣＲＩＳＰＲ相关蛋白质复合体与外源ＤＮＡ结合，将其切割长度为１７～４８ｂｐ的核酸小片段，再将这些小片段整合到宿主基因组上成为新的间隔序列，用于抵抗外源基因的干扰。Ｋ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ等［１４］研究发现，ＣＲＩＳＰＲ基因座上临近间隔序列的附近有几个非常保守的核苷酸序列，称为间隔序列临近基序———ＰＡＭ，被认为在ｃｒＲＮＡ特异性识别靶序列过程中发挥重要作用，不同的细菌和古细菌结构不同，在化脓链球菌中ＰＡＭ从５′端到３′端通常是ＮＧＧ。可变间隔区获得后是ＣＲＩＰＳＲ基因座的转录和转录后的成熟加工。即重复序列和间隔序列在前导序列的启动下转录形成ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ，再通过ＲＮａｓｅⅢ和Ｃａｓ９蛋白剪切成为成熟的ｃｒＲＮＡ，ｃｒＲＮＡ包含１个间隔序列和部分重复序列，与ｔｒａｃｒＲＮＡ和Ｃａｓ９蛋白质形成复合物后发挥作用。最后阶段即ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对外源核酸进行干扰。ｃｒＲＮＡ与ｔｒａｃｒＲＮＡ的互补区域形成双链ＲＮＡ，Ｃａｓ９核酸内切酶结构域也嵌在这一区域，形成核糖核蛋白复合物。ｃｒＲＮＡ上５′端约２０ｂｐ的特异序列可以识别特定ＤＮＡ互补序列，互补配对并解开ＤＮＡ双链，形成Ｒ－ｌｏｏｐ，另一条链保持游离状态，该链上与ｃｒＲＮＡ识别靶序列的对应部位称为前间区，前间区３′端邻近的３个碱基即为ＰＡＭ，被认为是ｃｒＲＮＡ识别特异性序列所必需的。复合体结合后，Ｃａｓ９蛋白中ＨＮＨ结构域能够剪切与ｃｒＲＮＡ互补的ＤＮＡ链，而ＲｕｖＣ结构域剪切非互补链，双链断裂后在ＤＮＡ损伤修复时便会造成插入、缺失和无效突变，从而完成对外源核酸的干扰，见图１。３　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的应用３．１　在动物中的应用　　自２０１２年研究人员首次利用ＣＲＩＳＰＲ系统在体外成功切割目的ＤＮＡ发现了ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃＲＮＡ、Ｃａｓ９蛋白的相互作用以来，该技术取得了突飞猛进的进展，迅速被应用于真核生物的基因编辑研究中，包括人类、大鼠、小鼠、斑马鱼等模式生物，以及猪、牛、羊等大型家畜。　　Ｊ．Ｆ．Ｌｉ等［１５］通过ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对多种人·５７·№．０４，２０１７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图１　ＣＲＩ