环境微生物学第1章--病毒01

第一章非细胞结构的超微生物——病毒第一篇：微生物学基础•病毒是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感宿主体内，可通过细菌过滤器，大小在0.2μm以下的超微小微生物。一、病毒的特点形体极其微小。必须在电子显微镜下才能观察，一般都可通过细菌滤器（孔径为0.45μm或0.22μm）；非细胞结构。故也称分子生物；其主要成分仅有核酸和蛋白质两种；专性寄生。必须寄生在活的敏感宿主细胞内，它们在活细胞外仅表现为生物大分子的特征，只有进入宿主细胞后才表现出生命的特征。只含DNA或RNA的遗传因子。二、病毒的分类（自学）1971年以后，国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeforTaxonomyViruses,ICTV）建立了统一的病毒分类系统。在2005年7月第八次发布：将病毒分为3个目，73个科，11个亚科，289个属，1950个种。病毒分类是根据宿主、所致疾病、病毒粒子的大小、病毒的结构和组成，核酸的类型、复制的模式，有或无被膜等进行。根据核酸分类：DNA病毒和RNA病毒根据专性寄主分类：植物病毒、动物病毒、细菌病毒（噬菌体）、放线菌病毒（噬放线菌体）、藻类病毒、真菌病毒。根据所致的疾病可分为：流行性感冒病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等动物性病毒；以及烟草花叶病毒、水稻萎缩病毒、番茄丛矮病毒等植物性病毒。病毒的分类–动物病毒寄生在人体和动物体内引起人和动物疾病：如流行性感冒、水痘、麻疹、腮腺炎、乙型脑炎、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎、天花、爱滋病等。–植物病毒引起植物疾病：烟草花叶病、番茄丛矮病等。–噬菌体寄生在细菌体内引起细菌疾病。用蓝细菌噬菌体控制水华。冠状病毒水生动物皮瘤中的虹色病毒IvanovskyBeijerinkWendellStanley三、类病毒和朊病毒•类病毒：比病毒更加小，为环状单链RNA，约有250～370个核苷酸长度，可通过机械途径或花粉或胚珠在植物间传播，在宿主内复制。类病毒可引起马铃薯纺锤形块茎病、柑橘裂皮病和化菊矮病。•朊病毒：是一种引起牛、羊疾病的感染因子（蛋白样感染颗粒），没有检测到核酸存在。朊病毒可导致退化性神经系统紊乱的疾病，如羊瘙痒症。可引起人和动物的神经性疾病，如牛海棉状脑病（BSE或疯牛病）致使家族性痴呆。二、病毒的形态和结构1、病毒的大小•测量的单位是纳米，多数病毒粒子的直径在10~300nm左右。•不同病毒的大小差别较大。病毒和细菌的相对大小支原体痘病毒疱疹病毒流感病毒1μ葡萄球菌细小核糖核酸病毒最大与最小的动物病毒天花病毒200×300nm脊髓灰质炎病毒口蹄疫病毒10nm2、病毒的形态•动物病毒：球形、卵圆形、砖形等。•植物病毒：杆状、丝状和球状。•噬菌体：蝌蚪状和丝状。•病毒的化学组成–病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白质。–核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心（核酸内芯）或基因组；–蛋白质包围在核心周围，构成了病毒粒子的衣壳。衣壳是由许多在电镜下可辨别的形态学亚单位——衣壳粒所构成。–有些病毒含有类脂质和多糖（被膜）3、病毒的化学组成和结构•病毒的结构裸露病毒粒子：不具被膜(亦称囊膜)在核衣壳外面有被膜包围所构成的病毒粒子。艾滋病病毒蛋白质衣壳•病毒的对称性构型立体对称型：主要为20面体,如腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、SARS病毒、禽流感病毒等。螺旋对称型：烟草花叶病毒、狂犬病毒、流感病毒。复合对称型：大肠杆菌T系噬菌体，头部呈立体对称型(20面体)，尾部为螺旋对称型。•蛋白质衣壳的功能：–保护病毒使其免受环境因素的影响；–决定病毒感染的特异性，使病毒与敏感细胞表面特定部位有特异亲和力，病毒可牢固的附着在敏感细胞上；–病毒蛋白质还有致病性、毒力和抗原性。腺病毒粒子的三维结构人体腺病毒负染照片腺病毒结构（多面体对称）A.SARS病毒的结构图B.电子显微镜下的SARS病毒H5N1型禽流感病毒烟草花叶病病毒的结构（螺旋对称）RNA核壳体烟草花叶病毒的杆状壳体由2130个壳粒螺旋排列而成，大约有130个螺旋。大肠杆菌的T4噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。大肠杆菌的T4噬菌体结构（复合对称型）病毒的核酸•DNA(脱氧核糖核酸)。•RNA(核糖核酸)•动物病毒有的含DNA，有的含RNA。•植物病毒大多数含RNA，少数含DNA。•噬菌体大多数含DNA，少数含RNA。•病毒核酸的功能：决定病毒遗传、变异和对敏感宿主细胞的感染力。病毒的被膜(囊膜)：类脂质中50%～60％为磷脂，其余为胆固醇。具有被膜病毒：痘病毒、腮腺炎病毒、流感病毒等。•基本特点：无生长过程；不是以二分裂方式繁殖；由病毒基因组的核酸指令宿主细胞复制大量病毒核酸，继而合成大量病毒蛋白质，最后组装成大量子病毒，并从宿主细胞中释放出来。•以噬菌体为例。吸附、侵入、复制、成熟（装配）、裂解和释放。三、病毒的增殖过程1、病毒的增殖过程吸附吸附是噬菌体与细菌表面受体发生特异性结合的过程，其特异性取决于噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性。T-偶噬菌体感染大肠杆菌的扫描电镜噬菌体大肠杆菌T4噬菌体感染大肠杆菌的电镜照片吸附脱壳侵入复制合成装配释放T噬菌体的侵染复制过程受体（脂蛋白、脂多糖）②侵入：噬菌体吸附在细菌细胞壁的受体上以后，核酸注入细菌细胞中，蛋白质壳体留在外面。从吸附到侵入，时间间隔很短，只有几秒到几分钟。侵入方式：注入（细菌病毒）伤口、昆虫刺吸（植物病毒）吞噬（动物病毒）•③核酸复制：噬菌体核酸进入寄主细胞后，操纵寄主细胞的代谢机能，大量复制噬菌体核酸，但不形成带壳体的粒子，称为潜育期。•④成熟（装配）：寄主细胞合成噬菌体壳体，形成完整的噬菌体粒子。•⑤裂解和释放：噬菌体粒子成熟，引起寄主细胞的裂解释放出病毒粒子。随种类不同，一个寄主细胞释放10～1000个噬菌体粒子。噬菌体吸附、侵入宿主菌内复制（合成）、聚集与释放全过程根据噬菌体与宿主菌的相互关系，噬菌体可分为两类：毒性噬菌体(virulentphage)：能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。温和噬菌体(temperatephage)：噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代。2、噬菌体的溶原性细菌受噬菌体感染后的两种反应A.裂解反应B.溶原性反应整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为前噬菌体(prophage)，带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌(lysogenicbacterium).前噬菌体偶尔可自发地或在某些理化和生物因素的诱导下脱离宿主菌基因组而进入溶菌周期，产生成熟噬菌体，导致细菌裂解。温和噬菌体这种产生成熟噬菌体颗粒和溶解宿主菌的潜在能力，称为溶原性(lysogeny)。溶原性具有遗传性和免疫性。温和噬菌体溶原性噬菌体的命名在敏感菌株的名称后面加一个括号，在括号内写上溶原性噬菌体λ。大肠杆菌溶原性噬菌体的全称为EscherichiacoliK１２(λ)Escherichia是大肠杆菌的属名，coli是大肠杆菌的种名，K１２是大肠杆菌的株名，括号内的λ代表溶原性噬菌体。四、病毒的测定与培养（自学）病毒的测定病毒颗粒计数法间接计数法病毒感染效价测定法（一）病毒的测定1、病毒颗粒计数法用电子显微镜直接计数。用于已知形态病毒的浓缩样品的计数。测定方法：将病毒样品与已知浓度的乳胶小颗粒均匀混合，然后将混合液均匀喷洒在已包被的样品方格网上，分别计乳胶颗粒和病毒颗粒数目。病毒的浓度可由样品中两种颗粒的比例和乳胶颗粒浓度计算得出。2、间接计数法血细胞凝集试验（hemagglutinationassay）计数测定方法：分别将红细胞与一系列10倍稀释的病毒样品混合，再观察结果。以能引起血细胞凝集的最高稀释倍数（或稀释倍数的倒数）为病毒的效价。3、病毒感染效价测定法病毒感染效价测定法与病毒培养方法基本相同。（二）病毒的培养特征1、病毒在液体培养基中的培养特征将噬菌体的敏感细菌接种在液体培养基中，经培养后敏感细菌均匀分布在培养基中而使培养基浑浊。然后接种噬菌体，敏感细菌被噬菌体感染后发生菌体裂解，原来浑浊的细菌悬液变成透明的裂解溶液。噬菌体在液体培养基中的培养特征A.被噬菌体感染之前培养液浑浊B.被噬菌体感染之后培养液变清2、病毒在固体培养基上的培养特征将噬菌体的敏感细菌接种在琼脂固体培养基上生长，形成许多个菌落，当接种稀释适度的噬菌体悬液后引起点性感染，在感染点上进行反复的感染过程，宿主细菌菌落就一个个地被裂解成一个个空斑，这些空斑就叫噬菌斑。噬菌体在固体培养基中的培养特征C.细菌菌落，D.四个菌落被噬菌体感染成噬菌空斑噬菌斑（三）病毒的培养基病毒的培养基应具备的条件：①必须是活的敏感动物或是活的敏感动物组织细胞；②能提供病毒附着的受体；③敏感细胞内没有破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶，病毒进入细胞就可增殖。1.脊椎动物病毒培养基①人胚组织细胞②人组织细胞③人肿瘤细胞④动物组织细胞⑤鸡、鸭胚细胞⑥敏感动物2.植物病毒的培养基与相应的敏感植株和敏感的植物组织。3.噬菌体的培养基与噬菌体相应的敏感细菌，如大肠杆菌噬菌体用大肠杆菌培养。（四）病毒的培养1、病毒样品的采集与制备病毒存在于动、植物病灶组织、体液、分泌物、粪便、下水污泥、活性污泥、污水、河水、湖水、海水等处。固体病毒样品采得后，加液体培养基制成悬液，以10000r/min离心10min，去除杂质，取其上清液备用。液体病毒样品直接以10000r/min离心10min，去杂质，取其上清液备用。空气病毒样品采用真空泵抽取至长有宿主菌的平板上，或是将长有宿主菌的平板打开盖，在空气中暴露30～60min以收集。若样品中病毒浓度大则要适当稀释，若样品中的病毒浓度小则要浓缩。2、动物病毒的培养：动物病毒的空斑试验(1)单层细胞的制备和培养：用无菌小刀将动物组织切成0.5～1mm3的小块，用平衡盐溶液(Hank's或Earle's)洗涤数次，加体积分数5％胰酶消化10～15min(有的消化时间长至30min，甚至十几小时)，将细胞间的“间质蛋白”水解，使细胞分散，将胰酶冲洗掉，吹散细胞并计数。加入含牛血清的生长液，分装，保持37℃温度，培养2～3d即长成单层细胞，以备培养病毒用。还可经传代后再培养病毒。(2)动物病毒的接种与观察①将病毒悬液置于单层细胞的表面，经适当时间孵育，使病毒最大限度地吸附在宿主细胞上。②将软琼脂或羧甲基纤维素注入铺在单层细胞表面，经过一定时间培养，结果在单层细胞上呈现出空斑。③以出现的空斑数判断病毒数ηPFU（病毒空斑单位）。3、噬菌体的培养和测定•噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。•双层琼脂平板法–倒下层琼脂：融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。–倒上层琼脂：融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌(大肠杆菌)菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。–恒温培养：30℃恒温培养6～12h观察结果。–观察结果：如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑。五、环境因子对病毒的影响1、物理因素•对病毒影响最大的物理因素是温度、光和干燥。（1）温度•在宿主细胞外的病毒大多数在55～65℃范围内不到1h灭活。•高温使病毒的核酸和蛋白质衣壳受损伤，蛋白质的变性作用阻碍了病毒吸附到宿主细胞上，削弱了病毒的感染力。•低温不会灭活病毒，通常在-75℃保存病毒。（2）光及其他辐射紫外辐射：紫外辐射具有灭活病毒的作用，灭活的部位是病毒的核酸，使核酸中的嘧啶环受到影响，形成胸腺嘧啶二聚体。尿嘧啶残基的水合作用也会损伤病毒。紫外辐射的致死作用会随培养基的浊度和颜色的增加而降低。可见光：在天然水体和氧化塘中，日光对肠道病毒有灭活作用，在低浊度（1.7NTU)的水中，当平均光强2.7J/(cm2·min)，平均温度26℃时，