第十章--酶的作用机制和酶活性的调节讲义

中国海洋大学海洋生命学院生物化学讲义2007年1第十章酶的作用机制和酶的调节目的和要求：理解、掌握酶活性部位的相关概念和特点；掌握酶催化高效性的相关机理；了解几种酶的催化机制，理解结构和功能的适应性；了解酶活性的调节方式，掌握酶活性的别构调节、可逆共价调节和酶原激活调节方式及生物代谢中的作用。一、酶的活性部位㈠酶的活性部位的特点1、概念：三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活性部位。结合部位：专一性催化部位：催化能力，对需要辅酶的酶分子，辅酶或其一部分就是活性中心的组成部分；组成酶活性部位的氨基酸数目对不同酶而言存在差异，占整个酶氨基酸残基小部分酶活性部位的基团：亲核性基团，丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：天冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。2、特点⑴活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分（1%～2%）⑵酶的活性部位是一个三维实体⑶酶的活性部位并不是和底物的形状互补的⑷酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂隙内⑸底物通过次级键结合到酶上⑹酶活性部位具有柔性㈡研究酶活性部位的方法1、酶分子基团的侧链化学修饰⑴非特异性共价修饰：活力丧失程度与修饰剂浓度有正比关系；底物或可逆的抑制剂可保护共价修饰剂的修饰作用。⑵特异性共价修饰：分离标记肽段，可判断活性部位的氨基酸残基，如二异丙基氟磷酸（DFP）专一性与胰凝乳蛋白酶活性部位丝氨酸残基的羟基结合。⑶亲和标记：利用底物类似物和酶活性部位的特殊亲和力将酶加以修饰标记来研究酶活性部位的方法。修饰剂的特点：①结构与底物类似，能专一性引入到酶活性部位；②具活泼化学基团，能与活性部位某一氨基酸共价结合，相应的试剂称“活性部位指示剂”。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，TPE是酶的底物，TPCK是酶的亲和试剂，当酶与TPCK温浴后，酶活性丧失，这种结合具有空间结构的需求，同时也阻止其他试剂如DFP结合。对酶活性中心的组氨酸咪唑环进行修饰。⑷自杀性底物标记：底物与酶结合并被催化所生成的产物可以与活性部位的基团专一性结合从而抑制酶的催化活性。2、动力学参数测定法：通过动力学方法求得相关参数，作出相应判断。3、X-射线晶体衍射法：如溶菌酶和胰蛋白酶活性中心的测定中国海洋大学海洋生命学院生物化学讲义2007年24、定点诱变法：改变编码蛋白质的DNA基因，研究酶活性部位的必需氨基酸。如胰蛋白酶定点突变，Asp102诱变为Asn102，Kcat降低5000倍。二、酶催化反应的独特性质1、酶反应分为两大类，电子转移；电子、质子或其他基团转移2、催化过程中以活性部位氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介3、酶催化反应的昀适pH和温度范围窄4、酶分子结构和活性部位特点利于催化反应：①酶分子特定的三维结构维持酶活性部位的构象；活性部位多位于酶分子的狭缝处，利于底物结合和酶构象的改变；②活性中心存在结合部位，使底物以固有的方式结合在活性部位，多底物反应存在多个底物结合位点，保证反应有序进行；③活性部位存在一个以上的催化基团，所以能进行协同催化；④底物结合后，活性部位能诱导底物键能的变化，利于过渡态复合物的形成三、影响催化效率的有关因素探讨酶作用高效率的原因及酶促反应的重要中间步骤㈠底物和酶的邻近效应与定向效应邻近效应提高了酶的活性中心底物的浓度，定向效应缩短了底物与催化基团间的距离；酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，使有效浓度得以提高，从而使反应速度增加（成功率）108倍。㈡底物的形变和诱导契合酶构象变化同时底物分子也发生变形，构象的变化，使得酶与底物间产生相互作用，电子云重新排布，电子张力更易于发生反应，形成一个互相吸引的酶与底物复合物。如乙烯环磷酸酯的水解；溶菌酶与底物的结合；羧肽酶催化中的电子云形变。㈢酸碱催化酶活性中心提供H+或提供H+受体使敏感键断裂的机制称酸碱催化。每一分子上氨基酸侧链基团可以为反应提供质子或接受质子从而加速反应的速度。影响酸碱催化的反应速率的因素有两个：1、酸或碱的强度；2、质子传递速率。在中性条件下，His咪唑基有一半以酸性形式存在，另一半以碱性形式存在；既可以作质子供体又可以作质子受体。而且给出质子接受质子的速度快。㈣共价催化酶活性中心亲电基团或亲核基团参与底物敏感键断裂的机制称共价催化，亲电基团——Mg2+、Mn2+（有空轨道）；亲核基团——OH、SH、咪唑基、某些辅酶（有孤对电子）。底物与酶形成一个反应活性很高的共价中间物。提高反应速度的原因：酶蛋白分子上亲核基团攻击含有酰基的分子形成酰基衍生物降低活化能；酰基从亲核基团再转移到昀终的酰基受体。㈤金属离子催化1、需要金属的酶分类：2、催化机制中国海洋大学海洋生命学院生物化学讲义2007年3⑴通过结合底物为反应定向⑵通过可逆改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应⑶通过静电稳定或屏蔽负电荷。㈥多元催化和协同效应几个基元反应配合在一起共同起作用。如胰蛋白酶、核糖酸酶等。㈦活性部位的微环境的影响非极性环境，底物分子敏感键和酶催化基团间有很大的作用力，有助于加速酶反应。水是极性分子减弱极性基团间的作用力，水同离子间相互作用形成水化层。有机介质中的酶促反应传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性，其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。优点：①利于疏水性底物的反应；②可提高酶的热稳定性，提高催化温度；③能催化在水中不能进行的反应；④可改变反应平衡移动方向；⑤可控制底物专一性；⑥防止由水引起的副反应；⑦可扩大pH值的适应性等等。四、催化反应机制的实例㈠溶菌酶1、结构相对分子量14.6×103，129个氨基酸组成的单链蛋白质，四对二硫键；空间结构上酶分子呈椭圆形，α螺旋占25%，某些区域存在伸展的β折叠片；分子表面有较深的裂缝，大小可容纳六个单糖分子，分子内部几乎全部为疏水性的；活性中心具有Glu35和Asp52，位于裂缝的两侧不同的微环境中，Glu处于非极性区，以质子化形式存在，Asp处于pH5.0极性区，以离子状态存在。2、酶的催化活性底物：N-乙酰氨基葡糖N-乙酰氨基葡糖乳酸的共聚物或几丁质催化机理：底物长度要求六个糖残基以上，与酶活性部位相适应；酶活性中心的Glu和Asp参与水解作用，将第四和第五残基间的糖苷键水解，水分子羟基结合C1，具体机理为：①底物进入活性中心，酶活性中心空间效应和Asp的作用下，诱导并使第四（D）残基由椅式变为半椅式，形成过渡态构象②Glu35的羧基提供一个H+，进行酸催化，使得四五残基间1-4糖苷键簖裂D残基C1与氧原子分开，并形成正碳离子过渡态③D残基正碳离子过渡态与溶剂中OH-结合。㈡胰核糖核酸酶A1、作用：专一性水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，生成嘧啶核苷酸或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸。2、结构Moore和Stein测定该酶一级结构，124氨基酸残基组成，含4对二硫键，Richards和Wyckoff对其三维结构进行分析。分子表面有一裂缝，His12、His119、Lys41为其酶活性基团，RNA分子进入后，能与活性中心结合部位基团间结合，嘌呤核苷酸结合后，His12和核糖C-2’-OH之间距离增加了0.15nm，无催化活性。中国海洋大学海洋生命学院生物化学讲义2007年43、催化机理特定核酸分子进入活性部位后，通过与结合部位结合和酶构象变化，使酶催化部位与底物部位靠近。①His12作为碱，与核糖C-2’-OH的质子结合，促使C-2’-O2-与磷酸环化，His119作为酸，提供质子，使3-5磷酸二酯键断裂，生成C-5’-OH②His12作为酸，His119作为碱（先与H2O结合），使磷酸水解断开③Lys41正电荷对磷酸环化和开环过程中过渡态五磷酸的瞬时形成有关。㈢丝氨酸蛋白酶酶家族，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂等1、消化作用的丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶⑴结构上非常相似，包括一级结构和三维结构。⑵催化部位：完全一样，丝氨酸附近的氨基酸顺序相似，具有共同的催化三联体结构。在具有消化作用的丝氨酸蛋白酶类，其活性中心Ser、His和Asp相临，相互间通过氢键作用，催化蛋白质水解。在无底物时，His57未质子化，当Ser195羟基氧原子对底物进行亲核攻击时，His57接受羟基质子，Asp102的COO-能稳定过渡态中His57的正电荷形式，此外Asp102定向His57并保证从Ser195接受一个质子。咪唑基成为SerAsp间桥梁。⑶结合部位专一性差别的原因①胰蛋白酶：底部有天冬氨酸，非极性口袋可以深入带电荷的赖氨酸和精氨酸有静电②胰凝乳蛋白酶：非极性口袋提供芳香族大的非极性的脂肪酸③弹性蛋白酶：较浅的口袋有两个较大的缬氨酸苏氨酸挡住，只能让丙氨酸等小分子进入。2、丝氨酸蛋白酶的的催化机制⑴第一阶段--水解反应的酰化阶段：Ser-OH攻击酰胺键，敏感键断裂，胺氮获得咪唑基氢，羧化部分连到丝氨酸羟基上，胺端释放⑵第二阶段--水解反应的脱酰基阶段：His吸收H2O攻击Ser的羧化部分，酯键断裂释放底物，酶恢复自由状态。3、丝氨酸蛋白酶的趋异进化和趋同进化⑴通过基因突变，从同一个祖先取得不同的专一性，称为趋异进化，如丝氨酸蛋白酶的不同的专一性。⑵趋同进化，如丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶一级结构很不相同，其在进化过程中是独立发生的，其三维结构相差较大，但活性中心相似，具有相同的催化三联体结构，称丝氨酸蛋白酶异源的“趋同进化”。⑶蛋白水解酶催化类型：丝氨酸蛋白酶、锌蛋白酶、巯基蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。㈣天冬氨酸蛋白酶1、性质：蛋白水解酶，如，胃蛋白酶、凝乳酶、组织蛋白酶D、HIV-1蛋白酶等，酸性条件下呈现活性，活性部位有两个Asp，催化疏水氨基酸间肽键的断裂。2、结构：323-340个氨基酸残基，含两个相同结构域，折叠形成一个较深的裂缝，即酶的活性中心。3、催化机理：酸碱催化机制，两个Asp的羧基，一个为酸基团，一个为碱基团。中国海洋大学海洋生命学院生物化学讲义2007年5晶体结构分析表明：活性部位结构高度对称，两个天冬氨酸表现为“催化二联体”，即质子在自由酶或酶-底物复合物中可以被交替共价结合到任何一个天冬氨酸侧链羧基上，进行酸碱催化反应。五、酶活性的调节控制酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用，称为酶的调控部位。酶活性调控方式：调节酶浓度；通过激素调节酶活性；反馈抑制调节酶活性；抑制剂和激活剂对酶活性的调节；别构调节；可逆共价调节；酶原激活；同工酶调节。㈠别构调控别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性的状态。别构酶：具有别构调节效应的酶效应物或别构剂：使酶发生别构效应的物质，包括正效应物和负效应物同促效应：底物对别构酶的调节作用异促效应：非底物对别构酶的调节作用别构酶往往是代谢途径的调节酶1、天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)⑴嘧啶途径的终产物CTP反馈抑制ATCase底物天冬氨酸与氨甲酰磷酸对ATCase促进作用；非底物CTP对ATCase抑制作用，ATP对该酶促进作用⑵结构①大亚基叫催化亚基，有催化活性不与ATP和CTP结合②小亚基叫调节亚基，无催化活性，能与ATP和CTP结合③调节亚基二聚体位于赤道上；催化亚基三聚体位于赤道面上或下，中间有很大的空洞④具有两个催化中心，3个调节中心。⑶别构调节与四级结构变化别构激活剂使所有亚基向R型转变，而别构抑制剂使它向T型转化；在结构的转变中催化链被拉的彼此靠近，形成优化的活性部位。PALA的结合导致每一条催化链的三级结构的重要变化，酶由T型变为R型，底物类似物结合到一个三聚体的活性部位就能改变另外三聚体的结构。底物的协同作用和CTP的反馈抑制作用是通过长距离而传递的。2、别构酶的性质⑴别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成；调节部位与活性部位通过构象变化产生协同效应。