环介导等温扩增技术简介

环介导等温扩增技术PrincipleofLoop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增法为已知基因的检测提供“简便、快速、准确、廉价”的基因检测方法什么是环介导等温扩增？环介导等温扩增环介导等温扩增是“Loop-MediatedIsothermalAmplifi-cation”的简称，是一种“简单、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4个不同的引物然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65℃），经一个步骤即可完成。其扩增效率极高，可在15~60min内实现109~1010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需很据扩增产物的有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。环介导等温扩增有哪些优点？优点不需要使双链DNA先变性成单链，省时。扩增反应在等温下可持续进行。扩增的效率极高。针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本低廉。扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的片段，检测方法简单。环介导等温扩增引物如何设计？引物的设计首先在靶基因的3’末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5’末端设定B1、B2、B3三个区段，针对这6个区段可以设计4个引物。3’5’3’5’F3cF2cF1cB1B2B3B1cB2cB3cF3F2F1TargetDNAFIPF3PrimerBIPB3PrimerF1cF23’5’F35’3’5’3’5’3’B2B1cB31.FIP:FIP引物在3’末端含有与F2c互补的F2区段，在5’末端含有与F1c相同序列的区段。2.F3Primer:F3引物含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。3.BIP:BIP引物在3’末端含有与B2c互补的B2区段，在5’末端含有与B1c相同序列的区段。4.B3Primer:B3引物含有与目标DNA上的B3序列相同的区段。环介导等温扩增引物如何设计？引物设计要点关于各引物的设计，需要专门的支持软件：PrimerExplorer。设计中需特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。F2、B2、F3、B3的3’末端应极力避免AT碱基连续或过多。扩增领域为F2~B2区段间，引物应该在200bp以内。包含F2/B2在内的环状部分的长度在40~60bp范围内。各区段的Tm值应该在60~65℃之间。若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。引物应避免二次结构发生。各引物的3’端不可含有与其他引物互补的序列。具体引物设计信息请参照网页：（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）解离链解离链哑铃状模板构造形成的过程FIPBIPF3PrimerB3Primer＋＋环状结构环状结构环状结构循环扩增阶段和延伸循环阶段环介导等温扩增反应的体系环介导等温扩增法所需的试剂模板DNADNA扩增引物FIPF3BIPB3链置换型DNA聚合酶dNTPs反应缓冲液模板DNARNA扩增引物FIPF3BIPB3链置换型DNA聚合酶dNTPs反应缓冲液逆转录酶PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。环介导等温扩增反应的操作过程（标准法）环介导等温扩增法的操作步骤样本DNA/RNA提取等温扩增检测约0.5h1、试剂配制2、DNA/RNA提取3、环介导等温扩增反应（扩增）4、检测约1.5h环介导等温扩增反应的检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增实例NTCPS：等温扩增的阳性产物是片段大小不一的梯状条带。应用浊度检测环介导等温扩增反应的检测阳性阴性扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。dNTPsDNAPolymeraseDNA-(dNMP)n+nP2O7P2O74-+2Mg2+MgP2O7(白色沉淀)﹣+荧光目视试剂检测环介导等温扩增反应的检测钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。﹣+钙黄绿素Mn2+dNTPsMg2+DNA聚合酶扩增反应钙黄绿素Mn2+P2O74-焦磷酸锰（白色沉淀）应用浊度的实时检测环介导等温扩增反应的检测如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁）的浊度进行测定。LAMP与普通PCR的比较缺点灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。